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玉米螟P450基因cDNA的克隆及植物次生物质对其诱导表达被引量：6: 2009年; 昆虫细胞色素P450是一类在生物代谢中起重要作用的基因家族,承担着许多重要的生理功能,包括对植物次生物质代谢和杀虫剂解毒等.本研究以玉米螟5龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据不同昆虫P450基因家族保守氨基酸序列,设计并合成简并引物,利用RT-PCR扩增出了玉米螟细胞色素P450基因cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体进行序列测定.测序获得了编码213个氨基酸残基的641 bp的DNA片段,命名为OfP450(GenBank登录号:EU807990);与已公布的棉铃虫、家蚕、欧洲防风草结网毛虫、小菜蛾和黑腹果蝇等的细胞色素P450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为55%、50%、49%、44%和31%.将植物次生物质棉酚、丁布添加入人工饲料中,对玉米螟进行了饲喂实验,采用优化半定量RT-PCR,以18SrRNA为内标,RT-PCR检测进食棉酚、丁布植物化合物的玉米螟中肠P450基因的转录.结果表明,其转录水平能被棉酚、丁布显著诱导.提示本实验克隆的玉米螟细胞色素P450对植物次生物质的代谢作用与P450表达量呈正相关.该研究为下一步将植物介导的RNA干扰技术应用于害虫生物防治提供坚实的基础.; 张雨良曾洪梅杨秀芬杨峰山刘华尹富仕毛建军邱德文; 关键词：玉米螟 P450基因克隆植物次生物质

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定被引量：3: 2007年; 从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。; 刘文平曾洪梅刘延锋袁京京邱德文; 关键词：蛋白激发子毕赤酵母表达系统

大麦产量相关基因HvYrg1的克隆及植物RNA干扰载体的构建被引量：2: 2009年; 大麦谷粒是受多个数量性状基因(QTL)控制的复杂性状,而RINGE3泛素连接酶在决定大麦产量和蛋白质降解途径中起到极为重要的作用。本研究按照同源克隆的方法,依据水稻、拟南芥、玉米、小麦和酵母等E3泛素连接酶保守区域设计引物,采用RT-PCR方法从西藏大麦中克隆出产量相关基因HvYrg1全长cDNA序列,包括完整的开放阅读框架(ORF)1275bp,编码蛋白为424个氨基酸(GenBank No.EU333863)。同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的水稻GW2基因同源性最高为86%。以植物表达载体pCAMBIA2300-35s-OCS质粒为基础,构建由35s启动子调控的HvYrg1基因的RNA干扰载体pCAM-RNAi-HvYrg1。这一载体的成功构建为研究该基因在作物产量的功能鉴定打下了很好的基础。; 张雨良王希东张桦杨峰山姚正培石庆华; 关键词：大麦克隆 RNA干扰

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北京市重大项目(D0706005040431)