国家自然科学基金(30700930)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 大鼠癌钙调蛋白基因原核表达载体的构建及表达
- 2010年
- 目的 在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）基因,并对构建的原核表达质粒进行表达和鉴定.方法 取SD大鼠6只,提取腹腔巨噬细胞并活化,提取总RNA,设计引物对OM基因进行RT-PCR扩增.通过中间载体pUC57进行目的 基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体pET-22b（＋）连接,转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR筛选阳性克隆后小量提取质粒,送样行核苷酸序列分析鉴定.成功构建的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组体的表达,并用Western blot鉴定表达产物.结果 琼脂糖凝胶电泳获得目的 基因OM,大小为350 bp左右,与预期的目的 基因大小一致.构建的重组质粒pET-22b（＋）/OM菌检PCR获得长度为500 bp左右的阳性克隆,与预期大小一致.抽提质粒经核苷酸序列分析后表明,克隆的片段与OM基因序列一致.在IPTG的诱导下,重组体表达出分子量约11.7 kD的表达产物,Western blot结果证实其为目的 蛋白.结论 实验成功构建了OM基因原核表达载体及其表达,为该蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础.
- 薛峥石燕红朱彤马丽娜胡丹崔志利
- 关键词：克隆基因表达
- 癌钙调蛋白／鱼精蛋白截短体融合基因在原核表达载体中的构建及鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的在原核表达载体中构建癌钙调蛋白(OM)/鱼精蛋白截短体(tp)融合基因,进行基因测序鉴定。方法提取SD大鼠腹腔巨噬细胞,并进行细胞计数,经巨噬细胞特异性抗体CD68鉴定。设计引物扩增OM基因,并在其3’端引入tp的编码基因,经PCR扩增获得OM/tp融合基因,通过中间载体PUC57进行目的基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体PET32a连接,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,小量提取质粒,送样经公司测序鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳获得OM/tp目的基因,与预期的目的基因大小一致,回收目的基因与中间载体PUC57连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PUC57-OM/tp,经测序鉴定后与预期的序列一致。质粒PUC57-OM/tp酶切后与载体PET32a连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PET32a-OM/tp经测序后与预期的序列一致。结论 OM/tp融合基因的成功构建,为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础。
- 石燕红薛铮朱彤马丽娜胡丹崔志利
- 关键词：鱼精蛋白融合基因原核表达
