国家自然科学基金(30700914)
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
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- 肺炎链球菌假想的溶菌酶样蛋白的活性分析和鉴定
- 2010年
- 目的 探索肺炎链球菌中一种假想的溶菌酶样蛋白的活性.方法 生物信息学分析该基因的功能结构域;利用长臂同源PCR对该基因进行敲除,观察D39野生菌和缺陷菌在生物学性状的改变;利用底物PNP-（GIcNAc）和溶壁微球菌,构建过表达载体,绘制生长曲线,对截断和全长蛋白的溶菌酶活性进行鉴定.结果 生物信息学分析结果显示该基因的编码产物为β-1,4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶,属于糖基水解酶25家族;野生菌为长链生长,缺陷菌呈短链状;溶菌酶和假想的溶菌酶样蛋白均可使底物释放出游离的对硝基苯酚,A405nm吸光度值分别为1.166和0.792;同时也可使得溶壁微球菌发生溶解;含过表达质粒的肺炎链球菌较之野生菌,溶解较快.结论 假想的溶菌酶样蛋白具有溶菌酶活性,是一种新的溶菌酶.
- 杨晓亮孟江萍崔亚利黄健刘鑫胥文春
- 关键词：肺炎链球菌溶菌酶
- 快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增技术的建立被引量：4
- 2010年
- 目的建立快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,探讨其用于淋球菌感染早期诊断的可行性。方法利用Primer-ExplorerV3软件分别针对淋球菌porA及16S rRNA基因设计6条引物(2条内引物FIP、BIP,2条外引物F3、B3,2条环引物LF、LB),以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,同时,以外引物F3、B3为PCR引物,进行PCR扩增,并比较2种扩增方法的灵敏度和特异性。结果LAMP法与PCR法灵敏度相同,可检测到10个拷贝的目的基因;其针对淋球菌porA和16S rRNA基因的引物对脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和大肠埃希菌的DNA均不能扩增。结论已成功建立了检测淋球菌porA和16S rRNA基因的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法。
- 崔亚利何於娟刘鑫胥文春刘明芳龚艺贺潇
- 关键词：淋球菌RRNA基因环介导等温扩增技术聚合酶链反应
- 一种溶菌酶样蛋白对肺炎链球菌毒力及荚膜多糖合成的影响
- 2011年
- 【目的】为了研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的一种假想的溶菌酶样蛋白在细菌生物学性状及其致病中的作用。【方法】利用长臂同源PCR对该基因进行敲出,并同时构建带有拯救质粒的缺失菌株,观察D39野生菌、缺失菌与带有拯救质粒的缺失菌株在相关生物学性状及其致病力改变,从而鉴定这种假想溶菌酶样蛋白的功能。【结果】缺失菌与野生菌相比,细菌生长减缓,毒力下降,荚膜多糖合成明显减少。而将拯救质粒转入缺失菌株后,该溶菌酶样蛋白的mRNA表达水平较野生菌高,其毒力及荚膜合成较缺失菌显著增高,但未达到野生菌水平。【结论】这种溶菌酶样蛋白是肺炎链球菌的一种新毒力因子,可能通过参与调控肺炎链球菌增殖及荚膜多糖的表达而影响毒力。
- 黄健姜学美黄美容杨晓亮刘明伟王虹孟江萍
- 关键词：肺炎链球菌溶菌酶毒力回复突变荚膜
- 肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析被引量：2
- 2010年
- 目的通过构建原核表达载体，获得纯化的肺炎链球菌S．pn重组假想蛋白SPD0873，并制备多克隆抗体，进一步分析其在常见S．pn菌株中的保守性。方法分离培养D39型肺炎链球菌，获取其基因组DNA。利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列，采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32（a）内，测序鉴定。将重组质粒转化到E．coli Rossetta（DE3）中，经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白，经Ni—NTA树脂纯化后，获得的重组蛋白用SDS—PAGE和Western印迹鉴定；将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体，并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价，Western印迹方法分析多克隆抗体的特异性，同时，鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符，并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达。纯化蛋白免疫BALB／C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体，Western印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体，同时，检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守，为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。
- 崔亚利王虹尹楠林龚艺牛司强尹一兵张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌表达纯化多克隆抗体
- 肺炎链球菌假想蛋白SPD-0873溶菌酶活性的分析和鉴定
- 目的:探索肺炎链球菌假想蛋白SPD-0873的溶菌酶活性。方法:通过生物信息学分析假想蛋白SPD-0873的结构功能域;体外表达纯化SPD-0873蛋白;按照经典溶菌酶活性试验,利用底物PNP-(GlcNAc),对SPD...
- 杨晓亮崔亚利王虹刘鑫庞丹班艳娜尹一兵张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌溶菌酶
- 文献传递
- 以gfp为报告基因的肺炎链球菌启动子诱捕文库的构建与分析被引量：2
- 2008年
- 首先构建一个以gfp(green fluorescence protein)为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP,将肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200bp^800bp)克隆到该质粒gfp基因上游的多克隆位点,得到约58000个含有肺炎链球菌基因组DNA随机酶切片段的重组子,提取质粒即为质粒库,该库大约覆盖肺炎链球菌基因组全长的5倍,插入率达到90%以上,且有较强的随机性,质量较高。将该质粒库转化入肺炎链球菌TIGR4菌株,带有随机片段的报告质粒通过同源重组的方式将gfp基因融合于细菌染色体上该随机片段之后,利用质粒的抗生素抗性基因筛选出重组菌株,从而构建出相应的菌株库,共获得包含约500000个肺炎链球菌转化子的菌株库,经体内、外实验表明,其包含插入了S.pn体内、外表达基因片段的细菌,可以报告特定条件下的基因表达,并可通过流式细胞仪识别、分选。该文库的构建为进一步利用差异荧光诱导技术筛选肺炎链球菌体内诱导基因奠定了基础。
- 胥文春赵清孟江萍单幼兰李南舒朝忠朱新华尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌绿色荧光蛋白
