国家高技术研究发展计划(81201)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达
- 2012年
- 目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。
- 牛明福吉萍武汉良邵勇高丽华胡显文
- 关键词：293细胞
