国家自然科学基金(30870266)
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
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- 人SUMO1基因的真核表达载体构建及其RNA干扰靶点筛选
- 2010年
- [目的]构建人SUMO1的真核表达载体,筛选SUMO1的有效干涉靶点。[方法]将SUMO1亚克隆至载体pCMV-HA中。寻找可能的干涉位点,合成上下游引物,退火后直接克隆入GFP-HU双启动子载体。用WesternBlot和细胞荧光的方法检测各载体对外源性SUMO融合蛋白表达的影响,其后检测对内源性SUMO1表达的敲降效果。[结果]构建的人SUMO1真核表达载体pCMV-HA-SUMO1测序正确。针对267、279、293、309、342、386等不同干涉靶点构建双启动子干扰载体,其中293位点的干涉载体在WesternBlot和荧光检测试验中均表现出稳定的敲降效果,抑制了SUMO1的表达。[结论]该研究成功构建了SUMO1的真核表达载体及具有明显敲降效果的干涉载体,可为后续研究奠定基础。
- 吴勇延肖亮单黎然宋振郭泽坤
- 关键词：RNA干涉
- 转录因子Sox2 SUMO修饰位点突变体的构建及真核表达
- 2009年
- 目的:构建Sox2及突变体Sox2 K247R的真核表达载体,并在293FT细胞中表达。方法:以含有Sox2基因全长的馈赠质粒为模板,用循环延伸PCR法得到该基因的突变体Sox2 K247R,并将野生型及突变型基因定向亚克隆到真核表达载体pCMV-HA上。得到的重组质粒经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定。其后用脂质体包埋法将pCMV-HA-Sox2及pCMV-HA-Sox2 K247R分别单独转染或与pCMV-Myc-SUMO1共转染293FT细胞。采用Western blot分析蛋白表达情况及SUMO修饰情况。结果:经酶切和DNA序列测定,重组子序列正确,突变体第247位密码子由AAG转变为CGG。West-ern blot结果显示野生型及突变型的Sox2都在细胞内得到了很好的表达,SUMO修饰位点突变后,Sox2不能与SUMO蛋白结合。结论:Sox2野生型及突变型真核表达载体构建成功,在蛋白水平体现了SUMO修饰的差异性。
- 郭泽坤吴先强单黎然宋振
- 关键词：SOX2SUMO亚克隆定点突变真核表达
- 蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的构建
- 2012年
- 【目的】构建一种可获得Sumo修饰蛋白的原核表达系统,为Sumo化修饰蛋白的批量制备奠定基础。【方法】用Trizol裂解法提取小鼠畸胎瘤细胞F9的总RNA,反转录成cDNA后PCR扩增获得Sumo1、Ubc9、Sae2和Sae1基因。将上述基因及相应载体酶切、连接后构建出重组质粒pACYC-Ubc9-Sumo1、pCDF-Sae2-Sae1。采用质粒转化-制备阳性克隆感受态细胞-质粒转化的方法获得pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1共表达的Su-mo化修饰的原核表达系统。以pGEX-GST-Sox2和pGEX-GST-Sox2K247R重组质粒为例,采用Western Blot检测蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的有效性。用另一Sumo修饰底物Oct4及其Sumo修饰位点突变的突变体Oct4K118R转化原核Sumo修饰系统,并连续传代,检测蛋白质Sumo化修饰系统的实用性及遗传稳定性。【结果】构建的蛋白质Sumo化修饰原核表达系统可特异修饰Sumo1的底物Sox2和Oct4;含有Oct4原核表达载体的蛋白质Sumo化修饰系统可稳定传至15代,系统的稳定性较好。【结论】获得了成本较低、特异性强、重复性好、稳定性强的可用于制备Sumo化蛋白的原核表达系统。
- 唐波杜娟杨力侠王小海吴海波吴勇延郭泽坤
- 关键词：SUMO原核表达OCT4SOX2
