国家自然科学基金(30972976)
- 作品数：8 被引量：17H指数：3
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- DNA甲基化对Ki-67启动子转录活性的影响被引量：6
- 2011年
- 目的观察DNA甲基化对Ki-67启动子转录活性的影响。方法使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，使用甲基化酶（M．SssI、M．HpalI、M．HhaI）诱导Ki-67启动子DNA片段发生不同程度的甲基化，将甲基化的启动子片段插入pGL3-Basic载体得到甲基化Ki-67启动子荧光素酶报告质粒，并以非甲基化Ki-67启动子荧光素酶报告质粒作为对照，分别转染正常细胞（HL-7702、HUVEC）和肿瘤细胞（A549、EJ、Kert-3、Hela和SGC-7901），使用双荧光素酶报告基因检测系统测定甲基化的Ki-67启动子在这些细胞中的转录活性。结果甲基化Ki-67启动子的转录活性均有不同程度的下降，其下降幅度依次为M．SssI处理组〉M．HhaI处理组〉M．HpalI处理组，其中M．SssI处理组启动子的转录活性几乎完全消失。结论Ki-67启动子的甲基化抑制了其转录活性，抑制程度与DNA甲基化程度和甲基化位置有关。
- 李望钱国伟徐为田卉李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中章龙珍郑骏年
- 关键词：DNA甲基化KI-67基因启动子转录活性
- 细胞核增殖抗原启动子调控荷载双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒的构建被引量：2
- 2012年
- 目的构建细胞核增殖抗原（Ki-67）启动子调控表达Ki．67基因和人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因小干扰RNA（siRNA）的条件增殖腺病毒。方法（1）合成hTERT—siRNA插入pSilenc—er3．1，构建pShTERTsiRNA质粒。（2）分别酶切Ki-67启动子质粒pZKi-67、Ki-67．siRNA质粒pZD55-Ki-67-siRNA，获得Ki-67启动子片段和Ki-67．siRNA片段并连接，构建质粒pZKi-67-ZD-Ki-67-siRNA。（3）以pShTERT—siRNA为模板，PCR获得hTERT—siRNA及H1启动子片段，克隆进pZKi-67-ZD—Ki-67-siRNA，构建质粒pZKi-67-ZD—Ki-67-siRNA．hTERT．siRNA。（4）将其与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染293细胞，9～12d后出现病毒空斑。提取重组腺病毒DNA，行聚合酶链反应（PCR）鉴定。结果病毒ZKi-67-ZD—Ki-67-siRNA—hTERT—siRNA构建成功，其包含Ki-67启动子、Ki-67-siRNA、hTERT—siRNA片段。结论成功构建Ki-67启动子调控荷载Ki-67、hTERT双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒，为研究靶向肿瘤治疗奠定基础。
- 陈仁富程伟松程乾李连涛方琳刘俊杰温儒民李望郑骏年
- 关键词：人端粒酶逆转录酶基因RNA干扰
- Ki-67启动子转录调控结构与功能研究被引量：4
- 2010年
- 目的 观察Ki-67核心启动子调控元件对转录调控的影响.方法 根据Ki-67启动子结构软件分析结果,对Ki-67核心启动子（-223～＋30）内的5个调控区域,包括（＋13～＋30）及4个潜在Sp1结合位点（-198～-172）、（-170～-144）、（-63～-37）和（-14～＋12）进行内部缺失,目的片段缺失的Ki-67核心启动子插入pGL3-Basic载体,构建报告基因重组体质粒.将重组体分别转染肿瘤Hela、SW1990、SGC-7901、A549细胞株,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,并与Ki-67核心启动子质粒pGLBK2＋转录活性比较.结果 缺失（＋13～＋30）的启动子重组体质粒在4种肿瘤细胞的转录功能均有显著提高,分别达到缺失前的1.2、2.0、1.7、1.4倍.缺失潜在Sp1结合位点的4个启动子重组体在4种肿瘤细胞的转录功能均有显著降低,其中缺失（-170～-144）后转录活性最小,在4种肿瘤细胞中分别降至未缺失前的16.2%、10.4%、6.7%、12.2%.结论 Ki-67启动子（＋13～＋30）区包含负性调控元件,对其缺失后形成的新的Ki-67核心启动子（-223～＋12）是更好的调控肿瘤基因治疗的启动子.（-198～-172）、（-170～-144）、（-63～-37）和（-14～＋12）可能存在潜在的Sp1顺式作用元件,其中-170～-144区域的顺式作用元件最为重要.
- 李中林钱国伟徐为李望张宝福刘俊杰陈菲菲田卉章龙珍郑骏年
- 关键词：KI-67基因启动子转录调控
- 野生型p53转录抑制肿瘤HeLa细胞Ki-67基因表达
- 2011年
- 目的观察野牛型p53对脖瘤HeLa绍庭Ki-67基因转录的影响。方法将不冠浓度的野生型p53表达质粒pCMV—p53（0．01、0．02、0．05、0．10和0．20Ixg）与Ki-67核心启动子质粒pGL-BK235瞬时共转染HeLa细胞，荧光素酶活性分析检测Ki-67核心启动子活性，逆转录-聚合酶链反应（RT～PCR）检测Ki-67mRNA表达。结果单独转染pGL3—8K235组相对荧光素酶活性为59．32±3．57，不同浓度pCMV—p53（0．01、0．02、0．05、0．10、0．20μg）处理组荧光素酶活性分别为32．03±0．59、21．67±0．38、13．03±0．49、9．63±0．42和9．61±0．11。除0．1、0．2μg浓度两组间差异无统计学意义（P〉0．05）外，其余各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）。随pCMV—p53转入量的增加，Ki-67mRNA的表达量显著下降（P〈0．05）。结论野生型p53过表达可以有效抑制Ki-67核心启动子的活性、下调Ki-67基因的转录。
- 李望王梅娟徐为钱国伟李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中裴冬生郑骏年
- 关键词：肿瘤P53转录
- RNA干扰对胃癌细胞Cullin1基因表达及细胞黏附的抑制作用
- 2011年
- 目的 探讨小干扰RNA（siRNA）对胃癌BGC823和MGC803细胞中Cullin1（Cul1）基因表达及细胞黏附力的影响.方法 体外化学合成Cul1 siRNA（si-Cul1）序列,同时合成Control siRNA（si-Ctrl）作为对照,在siLentFect Lipid Reagent介导下转染胃癌BGC823和MGC803细胞,Western blot检测Cul1蛋白及Src和FAK蛋白表达水平,用fibronectin包被96孔板行细胞黏附分析.结果 Cul1 干涉后胃癌BGC823和MGC803细胞株中Cul1、Src和FAK蛋白的表达均下降,同时胃癌细胞黏附于fibronectin包被板的能力降低.结论 Cul1 siRNA可以有效干涉胃癌BGC823和MGC803细胞中Cul1基因的表达,Cul1干涉后可能通过下调Src和FAK的表达水平进而降低胃癌细胞的黏附能力.
- 洪雯白津雍红梅郑骏年
- 关键词：胃肿瘤小干扰RNA
- Ki-67核心启动子内最关键Sp1顺式作用元件的确定
- 2011年
- 目的 确定Ki-67启动子内调控转录最关键的Sp1顺式作用元件,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 对Ki-67启动子内（-170～-145 nt）位置的Sp1顺式作用元件A2含有的两个Sp1一致性序列（-170/-160 nt）、（-159/-145 nt）分别作定点突变,把每个Sp1一致性序列的第3个碱基胞嘧啶＂C＂突变为胸腺嘧啶＂T＂,得到突变体MutA（-170/-160 nt）和MutB（-159/-145 nt）.使用双荧光素报告基因系统检测这些突变体在宫颈癌Hela细胞、人肾癌OS-RC-2和A549细胞中的转录活性.结果 2个Sp1一致性序列定点突变的启动子重组体在3种肿瘤细胞的转录功能均有显著降低,其中MutA在Hela细胞、OS-RC-2细胞、A549细胞中的活性分别降至突变前启动子活性的79.8%、65.9%、77.5%.MutB分别降至突变前启动子活性的36.9%、26.9%、28.6%.结论 Ki-67启动子-159～-145 nt区域的Sp1顺式作用元件对转录激活最为关键,起到调控肿瘤细胞Ki-67基因表达的作用.
- 李望钱国伟徐为田卉李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中章龙珍郑骏年
- 关键词：点突变转录因子SP1
- 转录因子Sp1对人Ki-67基因表达的调控作用被引量：3
- 2011年
- 目的 观察转录因子Sp1对人肿瘤细胞Ki-67基因表达的调控作用.方法 Sp1真核表达载体pN3-Sp1转染人宫颈癌Hela细胞、肾癌OS-RC-2细胞、肺癌A549细胞,蛋白免疫印迹法检测Hela细胞Sp1蛋白表达,细胞免疫组织化学检测3种肿瘤细胞Ki-67蛋白表达.pN3-Sp1与Ki-67基因核心启动子pGLBK235共转染上述3种肿瘤细胞,双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性.以空载体pN3作为对照.结果 转染pN3-Sp1的Hela细胞Sp1蛋白表达量,是空载体对照组的2.4倍.转染pN3-Sp1的3种肿瘤细胞Ki-67蛋白表达量与pN3转染组比较均显著增加.pN3-Sp1、pGLBK235共转染3种肿瘤细胞的启动子转录活性均较单转染pGLBK235显著升高,在Hela、OS-RC-2、A549细胞中的启动子活性分别为仅转染pGLBK235的1.68、 1.34、1.83倍.结论 转录因子Sp1具有激活Ki-67基因转录作用.
- 李望钱国伟徐为田卉李连涛刘俊杰陈菲菲李慧中章龙珍郑骏年
- 关键词：KI-67基因转录因子SP1
- Ki-67启动子内Sp1位点与Hela细胞核蛋白结合活性被引量：3
- 2010年
- 目的 观察Ki-67启动子内能与细胞核蛋白结合的转录因子Sp1结合位点,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 提取Hela细胞核蛋白.针对Ki-67启动子内4个潜在Sp1位点区域A1（-198～-172）、A2（-170～-144）、A3（-63～-37）、A4（-14～＋12）,以及没有Sp1结合位点的阴性对照区域C（-117～-91）,设计相应的Sp1一致性寡核苷酸探针和Sp1突变性寡核苷酸探针,凝胶阻滞电泳实验（EMSA）验证Sp1探针与Hela细胞核蛋白的结合活性.结果 EMSA显示A2、A3、A4一致性探针均可以和Hela细胞核蛋白结合,这种结合可以被相应的100倍浓度非标记的一致性探针竞争抑制,不能被100倍浓度的非标记的突变性探针所抑制.出现结合带的反应中加入Sp1抗体后观察到明显的Supershift现象.A1和C相应探针不能和Hela细胞核蛋白发生结合反应.结论 Ki-67启动子-170～-144、-63～-37和-14～＋12区域上存在能与肿瘤Hela细胞核蛋白结合的Sp1结合位点.
- 李中林钱国伟徐为李望李圆张宝福陈菲菲田卉章龙珍郑骏年
- 关键词：肿瘤细胞KI-67转录因子SP1
