安徽省高校省级自然科学研究项目(kj2010B239)
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
- 相关作者：陈晓鹏田野屠佳胡良鹤王永更多>>
- 相关机构：皖南医学院弋矶山医院南京市浦口区中医院更多>>
- 发文基金：安徽省高校省级自然科学研究项目安徽省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析被引量：2
- 2010年
- 目的构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNA HPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS)。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP-Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP-N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞)。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561 bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SP1、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N-myc和NGFI-p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP-Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP-N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP-Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明,pEGFP-Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体,该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强。
- 陈晓鹏胡良鹤王永
- 关键词：乙酰肝素酶启动子基因治疗
- 人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定
- 2013年
- 目的:初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶(HPSE)基因内具有增强子(enhancer,enh)活性的DNA片段。方法:增加Kpn I、Sal I酶切位点,将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)质粒载体pEGFP-N1改造为pEGFP-MU。选取HPSE基因5'端启动子上、下游的DNA序列并分为10个片段,分别命名为enhx(x分别等于1、2、3……10),每段长1 200 bp,相邻两段间重复200 bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒40(SV40)增强子序列,分别插入pEGFP-MU,以构建重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e,并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901,荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子(CMV)转录活性的影响。结果:琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示,PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示,重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e构建符合要求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现,重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFPMU-enh8在人BEL-7402、SGC-7901细胞中表达增强,与阳性对照质粒pEGFP-MU-SV40e相似,其余重组质粒表达较弱。结论:成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段,并正确构建重组质粒pEGFP-MUenhx;其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围,并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。
- 陈晓鹏杨来志葛国朝崔巍屠佳田野
- 关键词：乙酰肝素酶增强子启动子肿瘤质粒
- 乙酰肝素酶与肿瘤转移及治疗应用被引量：1
- 2012年
- 乙酰肝素酶（也称类肝素酶,heparanase,HPSE）是目前发现的动物细胞中唯一能够降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖侧链的内源性糖苷酶,与肿瘤侵袭和转移密切相关,可作为评价肿瘤患者临床预后的一个指标。
- 田野陈晓鹏
- 关键词：乙酰肝素酶肿瘤
- 乙酰肝素酶转录因子在恶性肿瘤中的表达调控
- 2012年
- 乙酰肝素酶（heparanase,HPSE）是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链—硫酸乙酰肝素的一种葡萄糖醛酸内切酶,在肿瘤的进展过程中发挥着重要作用。HPSE在恶性肿瘤中常有高表达,
- 屠佳陈晓鹏
- 关键词：乙酰肝素酶转录因子恶性肿瘤
- 克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析被引量：1
- 2012年
- 目的:克隆猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)增强子序列,修饰人乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因核心启动子,并分析其活性。方法:PCR扩增SV40增强子序列并测序鉴定,酶切连接插入到pEGFP-HPSEp中指定克隆位点构建重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh。将原质粒、重组质粒和阳性对照质粒分别转染肝癌细胞(HepG2)、喉癌上皮细胞(Hep2)和慢性白血病细胞(K562)。荧光显微镜观察和流式细胞术分析各质粒促转录活性。结果:扩增的SV40增强子序列长度为237 bp,序列分析与GeneBank收录一致。重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh经酶切和测序鉴定与预期结果一致,SV40增强子序列插入到指定克隆位点。荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-HPSEp-SV40enh的HepG2、Hep2和K562细胞均有较强荧光表达;转染pEGFP-HPSEp的细胞荧光强度均较弱。流式细胞术检测表明,pEGFP-HPSEp-SV40enh在HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.7%、6.0%和5.5%,pEGFP-HPSEp转染率分别为4.8%、13.4%和7.7%,两者比值均小于1。结论:成功克隆了SV40增强子序列并构建了重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh,SV40增强子可以初步提高HPSE启动子的活性。
- 王永陈晓鹏
- 关键词：乙酰肝素酶启动子增强子
