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国家自然科学基金(30972800): 作品数：15 被引量：32H指数：3; 相关作者：徐云升李秉煦欧荣英张学奇蔡剑峰更多>>; 相关机构：温州医学院附属第一医院第三军医大学温州医科大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金温州市科技计划项目更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

重组原核表达载体pGEX-4T-1-eIF5A的构建及表达被引量：1: 2012年; 目的构建人eIF5A基因的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pGEX-4T-1-eIF5A融合蛋白。方法以pCMV6-XL4-eIF5A作为模板,经PCR技术扩增目的片段,将获得的目的片段重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,经酶切鉴定、DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-eIF5A转化到E.coliBL21内,经IPTG诱导后,GSTpull-down后SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测人eIF5A的表达。结果成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-eIF5A,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,GSTpull-down后电泳分析以及Westernblot结果说明大肠杆菌BL21诱导后表达出人eIF5A的glutathioneS-transferase(GST)融合蛋白。功能研究初步证明重组eIF5A在细胞增殖过程中发挥重要作用。结论构建成功的重组原核表达载体能在E.coliBL21内表达eIF5A的GST融合蛋白,为进一步研究人eIF5A蛋白的结构和生理功能如促进创伤修复提供帮助。; 邱伟李向云王晓慧徐祥黄宏徐云升; 关键词：质粒融合蛋白

宫颈癌细胞GM-CSF与COX-2/iNOS表达的相关性研究被引量：1: 2014年; 目的研究宫颈癌细胞中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的表达对环氧合酶-2(COX-2)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,探讨GM-CSF在宫颈癌发生发展中的作用。方法收集临床宫颈癌标本52例及正常宫颈15例和宫颈上皮内瘤变(CIN)组织标本21例作为对照进行免疫组织化学染色,分析宫颈癌组织GM-CSF的表达与COX-2和iNOS表达的相关性;为了从细胞水平进一步论证其相关性,本实验使用宫颈癌细胞系Caski细胞,Caski细胞经GM-CSF转染后过表达GM-CSF,并通过RT-qPCR和Western blot检测COX-2和iNOS mRNA及蛋白的表达情况,以空质粒转染的Caski细胞为对照,在细胞模型中探讨GM-CSF强制表达对COX-2和iNOS表达的影响。同时,通过GM-CSF siRNA干扰Caski细胞GM-CSF表达后,用RTqPCR及Western blot方法检测iNOS/COX-2 mRNA及蛋白表达情况。结果免疫组化结果显示,宫颈癌组织GM-CSF表达明显低于正常组和CIN组(P均<0.05),而COX-2及iNOS的表达显著高于正常组(P<0.01),但与CIN组无明显差异;统计学分析发现GM-CSF与COX-2/iNOS的表达呈负相关(r=-0.542/-0.499)。细胞水平结果显示与空质粒转染的细胞相比,转染GM-CSF的Caski细胞COX-2/iNOS在mRNA及蛋白表达水平都有显著下降(P均<0.05);GM-CSF在被干扰后,干扰组与对照组相比COX-2/iNOS在mRNA及蛋白表达水平有明显差异(P均<0.05)。结论在组织和细胞表达水平GM-CSF与COX-2/iNOS的表达均呈负相关,GM-CSF可能通过下调COX-2/iNOS表达而具有抗宫颈癌作用。; 姜南雁聂刚邱伟袁跃跃倪兵徐云升; 关键词：GM-CSF 宫颈癌环氧合酶-2 诱导性一氧化氮合酶

HPV16E711-20-HSP110复合物的构建及其免疫原性研究被引量：1: 2010年; 宫颈癌是一种危害妇女健康的常见恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，其发生发展主要与高危型人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16和18型感染密切相关。因此，针对HPV研究、开发宫颈癌治疗性疫苗具有重要的临床意义。目前对于细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位的多肽疫苗的研究日益深入。; 丁珍珍徐云升欧荣英蔡剑峰任发亮倪兵贾正才林治华吴玉章; 关键词：高危型人乳头状瘤病毒 LYMPHOCYTE 复合物细胞毒T淋巴细胞治疗性疫苗妇女健康

GM-CSF在肿瘤免疫治疗中的作用最新研究进展被引量：10: 2015年; 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一种能够刺激骨髓细胞形成中性粒细胞集落和巨噬细胞集落,增强粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞杀菌、抗肿瘤作用的免疫细胞因子。研究表明,GMCSF可作为肿瘤疫苗的免疫佐剂提高肿瘤疫苗的免疫原性,增强疫苗的免疫调节作用且其毒性低,故成为目前研究热门的免疫佐剂,已经广泛应用于临床疾病的治疗。但近年来有报道表明,GM-CSF用于癌症患者治疗时出现了免疫抑制作用,而且肿瘤源性GM-CSF在机体内也发现有免疫抑制效应,因此,GM-CSF的作用机制及其作为肿瘤疫苗佐剂是否安全有待进一步探讨。本文就GM-CSF在肿瘤中的免疫效应最新研究进展作一综述。; 姜南雁唐隽徐云升; 关键词：GM-CSF 佐剂肿瘤免疫治疗疫苗

APL提高H2-D^b限制性天然CTL表位HPV-16E749-57免疫效应: 2009年; HPV-16E749-57是H2-D^b限制性免疫显性CTL表位，是治疗HPV-16相关病变的理想靶标，研制HPV-16多肽疫苗可以参考表位为基础。但天然表位HPV-16E749-57，的肿瘤免疫效果并不理想。对表位进行氨基酸置换修饰，筛选出免疫原性强的修饰多肽配体（APL），对构建HPV-16多肽疫苗有重要的意义。; 徐云升吴玉章任发亮倪兵贾正才欧荣英林治华张学奇李秉煦; 关键词：CTL表位免疫效应 APL HPV-16 多肽疫苗相关病变

HPV18 E77-15免疫原性的实验研究: 2012年; 目的鉴定抗原肽HPV18E77-15能否诱导HLA—A2＋健康供者的外周血淋巴细胞（PBL）产生抗原肽特异性细胞毒性T细胞（CTL），判断其是否具有免疫原性。方法通过体外细胞培养技术分为两组，实验组：负荷抗原肽为HPV18 E77-15，对照组：负荷的抗原肽为HBVc17-28，采用抗原肽负荷外周血单个核细胞（PBMC）及T2细胞作为抗原呈递细胞，重复刺激HLA—A2阳性健康供者的外周血淋巴细胞（PBLs），1周1次，共3次；分别在第1轮刺激后和第3轮刺激后，采用RPE标记的抗原肽特异性五聚体和FITC标记的CD8＋抗体通过流式细胞仪检测抗原肽所诱导产生的抗原肽特异性CTL的频率。结果在流式细胞仪检测中，实验组第1轮刺激后所选淋巴细胞群中CD8＋五聚体＋双阳性的抗原肽特异性CTL为（1．87±001）％，第3轮刺激后抗原肽特异性CTL增至（15．73±2．47）％；而对照组中未检出抗原肽特异性的CTL细胞增殖。结论抗原肽HPV18E77-15能够诱导产生抗原肽特异性CTL增殖，具有良好的免疫原性，可能成为针对HPVl8感染的治疗性多肽疫苗的候选表位。; 张乾徐云升朱雪洁李晓林杨孝军欧荣英郑飞云; 关键词：HPV18 抗原肽细胞毒性T淋巴细胞

儿童细菌性皮肤病的病原菌分布与耐药性分析被引量：7: 2010年; 目的分析细菌感染性皮肤病住院患儿病原菌分布及耐药性,指导临床合理用药。方法对253例细菌性皮肤病住院患儿进行细菌分离培养,VITEK-AMS60微生物鉴定仪进行病原菌鉴定和药敏试验。结果从253例患儿标本中分离出病原菌216株,其中葡萄球菌211株,占97.7%,A组β-溶血性链球菌(GABHS)5株,占2.3%。葡萄球菌药敏试验结果显示,对氨苄西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢唑林、红霉素、环丙沙星和复方磺胺甲噁唑,前3年组(2004—2006年)的耐药率分别为96.6%、94.3%、94.3%、82.8%、21.5%和25.3%,后3年组(2007—2009年)的耐药率分别为97.6%、95.2%、96.8%、91.1%、25.0%和31.5%,各组间差异无统计学意义(P>0.05);但前3年组对克林霉素和庆大霉素的耐药率分别为44.8%和26.4%,后3年组的耐药率分别为81.5%和65.3%,后3年组耐药率高于前3年组(P<0.01和P<0.01);5株GABHS中,4株对红霉素耐药、4株对阿奇霉素耐药,对青霉素、莫匹罗星全部敏感。尚未发现耐万古霉素的菌株。结论葡萄球菌是细菌性皮肤病的主要病原菌;葡萄球菌具有多重耐药性,对克林霉素和庆大霉素的耐药性在增高。; 陈仕胜蔡剑峰徐云升张学奇李秉煦; 关键词：皮肤感染葡萄球菌耐药性儿童

HPV16 CTL表位E749-57以HSP110为分子伴侣的免疫原性研究被引量：1: 2010年; 目的探讨以mHSP110为分子伴侣的HPV16 CTL表位E749-57的免疫原性.方法将mHSP110基因克隆、原核表达和纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定.在热休克状态与E749-57结合形成复合物,高压液相色谱（HPLC）鉴定其结合程度.用mHSP1 10-E749-57复合物免疫小鼠,IFN-γ胞内染色、MTT法检测小鼠脾细胞中特异CTL.结果克隆mHSP110片段经DNA序列测定与基因库中其CDS一致,长度为2577 bp 经SDS-PAGE和Western印迹证实mHSP110表达、纯化成功,HPLC分析E749-57能够与mHSP110形成复合物.复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞中CD8＋IFN-γ＋T细胞的频率、脾淋巴细胞增殖活性明显高于E749-57组、HSP110组和PBS组.复合物免疫小鼠可明显抑制TC-1肿瘤的生长.结论 mHSP110-E749-57复合物能诱导产生特异性CTL并产生抗肿瘤效应.; 任发亮徐云升欧荣英倪兵贾正才吴玉章林治华李秉煦郝飞; 关键词：人乳头状瘤病毒16 表位

人eIF4A3真核表达载体构建及稳定表达细胞株筛选被引量：2: 2011年; 目的构建人eIF4A3重组质粒载体,筛选高表达人eIF4A3的稳定细胞株。方法 RT-PCR克隆eIF4A3基因,将获得的基因片段分别连接到含有HA和c-myc标签的质粒载体上,转染HeLa细胞,经G418筛选获稳定表达细胞株,在体外翻译体系中进行体外翻译,通过免疫印迹鉴定eIF4A3的表达。结果成功构建人eIF4A3的真核表达载体,可在HeLa细胞中稳定表达,且能在体外翻译体系中翻译eIF4A3蛋白质。功能研究初步证明eIF4A3可以抑制荧光素酶报告基因的表达。结论获得了可稳定高表达人eIF4A3的HeLa细胞株及可用于体外翻译的真核表达载体。; 李向云徐祥李秉煦黄宏徐云升

宫颈癌患者外周血HPV16抗原特异性CD8^+细胞毒性T细胞的检测及意义被引量：1: 2010年; 目的:初步探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)阳性宫颈癌患者细胞免疫状况,了解其外周血抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞的水平。方法:采取免疫荧光标染重组MHCⅠ类分子-肽五聚体技术,运用流式细胞术定量检测患者和正常人外周血CD8+细胞毒性T细胞、记忆性细胞毒性T细胞、活化细胞毒性T细胞及HPV16抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞。结果:宫颈癌患者CD8+细胞毒性T细胞计数、记忆性细胞毒性T细胞计数、体内抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞计数和对照组比较差异无统计学意义,但活化细胞毒性T细胞计数低于对照组(P=0.322),体外经抗原肽刺激后抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞计数高于对照组(P=0.0068)。结论:HPV16阳性宫颈癌患者外周血中活化细胞毒性T细胞数目减少,表明患者细胞免疫功能受到一定的影响,通过抗原表位有效的诱导是提高患者的特异性细胞免疫功能的重要途径,运用五聚体技术检测宫颈癌患者抗原特异性细胞毒性T细胞,可初步反映患者特异性细胞免疫状态并有利于进行复发和预后分析。; 欧荣英徐云升吴玉章林治华郑飞云; 关键词：宫颈癌人乳头瘤病毒

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