江苏省高校自然科学研究项目(03KJB180082)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 相关作者：朱昌亮胡小邦孙艳马磊李秀兰更多>>
- 相关机构：南京医科大学更多>>
- 发文基金：江苏省高校自然科学研究项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cD NA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/chy,经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊细胞C6/36,通过G418选择培养,建立转染细胞系;用RT PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果成功构建了真核表达载体pIE13/chy,证明糜蛋白酶基因已转入C6/36细胞,建立了稳定转染细胞系,表达产物分子质量单位约30ku,与理论值相符。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。
- 顾燕公茂庆胡小邦孙艳马磊李秀兰朱昌亮
- 关键词：抗药性基因转染C6/36细胞
- 淡色库蚊抗药性相关基因——NYD-MLC2基因的克隆与分析被引量：6
- 2006年
- 目的:获取淡色库蚊抗药性相关基因NYD-MLC2的cDNA全长序列并鉴定其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因片段序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增NYD-MLC2基因3′、5′端,经对位拼接获得全长序列,并进行生物信息学分析;荧光定量PCR验证此基因在抗性和敏感品系的表达差异。结果:获得淡色库蚊NYD-MLC2cDNA全长序列,开放阅读框为630bp(GenBank/NCBIDQ140391),编码210个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-MLC2与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)一个未知功能的蛋白同源性最高,为91%;实时荧光定量PCR结果显示,NYD-MLC2在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的4.08倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因cDNA全长序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-MLC2与淡色库蚊溴氰菊酯抗药性相关,值得进一步研究。
- 钱瑾孙静孙立新孙艳胡小邦马磊朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊抗药性RACE定量PCR
- 淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的为进一步研究胰蛋白酶基因与抗药性的关系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的胰蛋白酶(trypsin)基因编码区。T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到昆虫细胞表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/try。经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊虫细胞C6/36,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞。用RTPCR、Westernblotting鉴定胰蛋白酶基因的转录表达。结果酶切和PCR鉴定表明,成功构建昆虫细胞表达载体pIE13/try;证实胰蛋白酶基因已转入C6/36细胞,并建立稳定转染细胞系,成功地表达目的基因。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究胰蛋白酶与抗药性的关系提供了良好的实验基础。
- 公茂庆顾燕胡小邦孙艳马磊李秀兰朱昌亮
- 关键词：抗药性基因转染C6/36细胞
