国家自然科学基金(30472172)
- 作品数：7 被引量：28H指数：2
- 相关作者：刘静叶玲刘建伟杜明梅翟冰更多>>
- 相关机构：中国人民解放军总医院中国中医研究院航天医学工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的建立被引量：1
- 2009年
- 目的:将糖尿病慢性并发症相关基因醛糖还原酶(aldose reductase,AR)基因与腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)表达载体pSNAV2.0重组,使其在HEK293细胞中表达,以基因工程表达的AR为靶向,建立醛糖还原酶抑制剂(aldose reductase inhibitor,ARI)细胞筛选模型。方法:首先采用酶切、连接等方法构建含有人AR基因序列的AAV表达载体pSNAV-hAR,将重组质粒转染HEK293细胞,通过活性测定、Western blot和免疫荧光检测目的基因转染及表达的情况。结果:PCR、酶切、DNA测序均证实表达质粒pSNAV-hAR构建正确。转染HEK293细胞后,一系列分析结果显示,腺相关病毒表达载体介导的AR真核细胞表达产物是具有功能活性的目的蛋白。应用经典醛糖还原酶抑制剂Sobinil和Zopolrestat对此模型进行了验证。结论:AR高表达细胞模型的建立,为进一步筛选ARI、探讨多元醇通路学说在糖尿病慢性并发症发病机制中的作用奠定了基础。
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- 关键词：醛糖还原酶腺相关病毒细胞模型
- AR-GFP融合基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 目的:构建由绿色荧光蛋白(GFP)标记的人醛糖还原酶(AR)融合基因真核表达载体并在HEK293细胞中表达。方法:应用DNA重组技术构建AR与GFP的融合基因(AR-GFP),将AR-GFP插入pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体中,通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞,倒置荧光显微镜评价转染效率,Western blotting技术检测AR基因在转染细胞中的整合及表达,分光光度法(UV法)测定AR表达活性,用公认的AR抑制剂(ARI)反证活性AR的存在。结果:荧光显微镜对转染细胞的观察及Western blotting结果证实AR-GFP融合蛋白在HEK293细胞中表达,UV法测活、ARI抑制试验均未证实其生物学活性。结论:转染的HEK293细胞可成功地表达AR-GFP融合蛋白,但不能成为ARI真核细胞筛选模型。
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- 关键词：醛糖还原酶绿色荧光蛋白基因表达HEK293细胞
- Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达被引量：22
- 2008年
- 构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体,并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列,+4位碱基分别为A和G,且不改变氨基酸编码,将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A,pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光表达,流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率,Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染HEK293细胞,其中流式细胞术分析显示:pHGFP-A组GFP阳性率约为15%,pHGFP-G组GFP阳性率约为45%;Western blot显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明,Kozak序列+4G(-3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用,可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。
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- 关键词：KOZAK序列绿色荧光蛋白WESTERNBLOT
- Sorbinil和Zopolrestat对酵母工程菌中人醛糖还原酶活性的抑制作用
- 2012年
- 目的利用人醛糖还原酶基因(AR)及其与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的酵母细胞表达模型,选用两种经典的AR抑制剂(ARI)-Sorbinil和Zopolrestat,初步观察模型在药物筛选方面的功能。方法复苏菌种并培养,在细胞培养液中加入ARI,观察细胞生长、GFP表达及荧光强度、AR蛋白表达及AR活性。结果 GFP荧光表达及AR蛋白的表达不受影响,但AR活性可被Zopolrestat抑制。结论 GFP标记的AR基因的酵母细胞模型可用于ARI的初步筛选,易重复,费用经济。Zopolrestat对酵母工程菌中表达的AR活性呈现出良好的抑制效应,可考虑作为该模型进行ARI筛选时的对照药物。
- 翟冰刘静刘建伟叶玲
- 关键词：醛糖还原酶酵母绿色荧光蛋白醛糖还原酶抑制剂药物筛选
- 人醛糖还原酶基因在酿酒酵母中的诱导表达及活性分析
- 2011年
- 目的建立人醛糖还原酶(AR)及其与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的酿酒酵母细胞表达株,检测细胞中目的基因的表达及蛋白活性。方法将含目的基因AR及融合基因AR::GFP的重组质粒pYEX-BX转化酵母细胞INVSc1,得到宿主菌株XAR,XAG及对照菌株YEX。观察酵母细胞生长曲线及GFP荧光信号;Northern blot检测细胞中AR mRNA转录;Western blot检测AR蛋白表达;荧光法测定AR活性。结果三菌株生长速率无明显差异;XAG菌株相对荧光强度与生长时间成线性关系;XAR,XAG菌株分别有持续、稳定的目的基因mRNA转录及目的蛋白表达,并具有AR活性。结论成功构建了AR基因的酵母表达株,为进一步将此细胞株应用于研究AR的致病机制及AR抑制剂的初步筛选打下基础。
- 翟冰叶玲刘静刘建伟
- 关键词：醛糖还原酶酵母绿色荧光蛋白质
- 糖尿病致病基因醛糖还原酶基因及其抑制剂筛选模型的构建及功能研究被引量：2
- 2009年
- 目的基因工程方法建立人醛糖还原酶基因(AR)的蛋白分子模型,并将该模型应用于中草药AR抑制剂的初步筛选。方法将含基因AR及融合基因AR∷GFP的重组质粒pcDNA3.1/myc-His-AR及pcDNA3.1/myc-His-AG瞬时转染HEK293细胞,分别命名为HAR、HAG细胞株。通过荧光显微镜观察AR∷GFP的绿色荧光直接判断转染效果及估计基因AR的表达;Western blot、紫外分光光度法检测AR蛋白表达及AR酶活性。应用此HAR模型对黄芩苷等5种中草药进行初步筛选,并与经典AR抑制剂Sorbinil、Zopolrestat的抑制效果比较。结果GFP绿色荧光表达丰富,表明质粒转染效率较高;Western blot和紫外分光光度法显示:转染后HEK293细胞中AR蛋白表达量高,AR酶活性强(空白对照的2.5倍)。AR抑制剂筛选实验揭示,黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等中草药表现出与Sorbinil相近的AR抑制活性。结论AR的蛋白分子模型成功建立,此模型可得到较大量高活性AR酶蛋白,并可应用于AR抑制剂的初步稳定筛选;黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等中草药显示出潜在的AR抑制活性。
- 杜明梅刘静翟冰刘建伟杨华张志华易红叶玲
- 关键词：醛糖还原酶醛糖还原酶抑制剂HEK293细胞
- 多寡核苷酸探针同步标记在Northern blot多基因分析中的应用被引量：2
- 2007年
- 目的:建立一种多探针同时标记同步杂交检测多基因的简化的Northern blot方法。方法:通过T4多聚核苷酸激酶5′末端放射性磷酸化标记法对Northern blot中多寡核苷酸探针同时标记,实现对同一张转移印迹膜上的多基因同步杂交显影检测。结果:与常规mRNA逐一检测的效果进行比较,同步简化法的各目的基因同时得到较好的检测。结论:同步简化法简化了实验过程,缩减了实验时间,节省了实验试剂,并使各基因表达丰度之间的比较具有更高的准确性,提高了Northern blot的检测效率和成功率。
- 杜明梅叶玲翟冰刘建伟刘静杨立娜
- 关键词：NORTHERNBLOT寡核苷酸探针
