国家自然科学基金(30872363)
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
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- 相关机构：重庆医科大学重庆医科大学附属第一医院更多>>
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- 肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡涉及MAPK1/3信号途径
- 2011年
- 目的探讨肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)对人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及机制。方法 MTT法检测Ply对THP-1细胞的增殖抑制。瑞氏染色观察Ply对人THP-1细胞形态的影响。AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡。琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象。免疫组化和Western blot检测MAPK1/3蛋白表达的变化。结果将人THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml Ply共同孵育后,在24、48、72、96 h用MTT法检测细胞增殖抑制率,发现Ply对人THP-1细胞具有明显的增殖抑制作用,并且呈剂量和时间依赖性,IC50(24 h)为1.31μg/ml;0.05μg/ml和0.1μg/ml Ply分别处理THP-1细胞12 h后,通过瑞氏染色法观察人THP-1细胞可见凋亡小体及核碎裂象等典型的凋亡形态学改变;用0.05μg/ml Ply和0.1μg/ml Ply作用THP-1细胞12 h后细胞早期凋亡率分别为11.83%和48.45%(P<0.05);提取凋亡THP-1细胞DNA,进行琼脂糖凝胶电泳可见典型的"梯状"条带;Ply作用于人THP-1细胞后,胞内MAPK1/3蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Ply可诱导人THP-1细胞凋亡,此作用涉及MAPK1/3信号通路的参与。
- 姜慧贺潇袁军王虹李忱炜董杰崔瑾董姗姗周爱娥张雪梅胥文春尹一兵何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素THP-1细胞凋亡
- 肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定被引量：7
- 2011年
- 目的体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性。方法分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coliRosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性。结果克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达。所获重组蛋白纯度达到95%。溶血实验显示Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖。细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525μg/ml。结论经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白。
- 贺潇袁军王虹李忱炜姜慧董杰崔瑾董姗姗周爱娥张雪梅胥文春尹一兵何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素原核表达
- 抗人脑钠肽前体氮端肽(NT-proBNP)单克隆抗体的制备及其性质鉴定
- 目的:制备抗人脑钠肽前体氮端肽(NT-proBNP)单克隆抗体并对性质其进行初步鉴定,为研制开发高灵敏度的免疫学方法检测人脑钠肽前体氮端肽的试剂盒提供基础。方法:利用sulfo-SMCC法将合成的人脑钠肽前体氮端肽的第1...
- 徐秀宇黄美容王鹏尹一兵胥文春
- 关键词：单克隆抗体
- 文献传递
- 肺炎链球菌溶血素黏膜免疫抗定植保护作用的研究
- 2011年
- 目的原核表达△A146Ply蛋白，评价△A146Ply黏膜免疫对肺炎链球菌（Streptococcuspneumon—ioe，5．Pn）在宿主鼻咽部定植的保护作用。方法IPTG诱导、Ni—NTA树脂纯化获得纯化的△A146Ply蛋白，经黏膜免疫BALB／C小鼠，制备其特异性抗血清；进行体内抗定植实验，观察小鼠鼻咽部灌洗液和肺部残存的细菌数量，检测△A146Ply黏膜免疫对19F型肺炎链球菌在鼻咽部定植的保护作用。为验证该保护作用是否具有广谱性，培养血清型14型、3型、6型和2型S．pn，经鼻腔感染免疫后小鼠，评价△A146Ply蛋白黏膜免疫对多株肺炎链球菌定植的保护作用。进行体外抗黏附实验，检测△A146Ply蛋白及其抗血清是否对无荚膜的肺炎链球菌R6黏附A549细胞具有抑制作用。结果获得了纯度〉90％的目的蛋白；体内实验结果显示，△A146Ply黏膜免疫可以显著降低肺炎链球菌19F在宿主鼻咽部和肺部残存的细菌数量（P〈0．01）；14型和3型肺炎链球菌在免疫后小鼠鼻咽部及肺部定植的数量均显著下降（P〈0．05），2型肺炎链球菌在免疫后小鼠肺部定植的数量显著下降（P〈0．05），6B型肺炎链球菌在免疫组与对照组小鼠鼻咽部及肺部均无显著差异（P〉0．05）；△A146Ply特异性抗血清△A146Ply蛋白对R6黏附A549细胞的抑制效应呈剂量依赖性。结论△A146Ply蛋白经黏膜免疫BALB／C小鼠可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著保护作用，为Ply作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的应用提供了实验依据。
- 杨晓丹袁军王虹尹楠林龚艺崔亚利尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌黏膜免疫
- 肺炎链球菌溶血素经死亡受体/Fas途径和线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡被引量：2
- 2012年
- 目的:探讨肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,Ply)对小鼠RAW264.7细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及机制。方法:Ply蛋白加入RAW264.7细胞培养上清与细胞共孵育。倒置显微镜观察Ply对RAW264.7细胞形态的影响。MTT法检测Ply对RAW264.7细胞的增殖抑制。Annexin V法检测细胞凋亡率。分光光度法检测Caspase-3、8、9活性。免疫细胞化学法检测到Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达。结果:Ply对小鼠RAW264.7细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞24小时后,可见典型的凋亡形态学改变;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞1小时和3小时后,细胞凋亡率分别为32.90%和51.56%(P<0.05);1μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞24小时,Caspase-3、8、9活性均比对照组升高(P<0.05);免疫细胞化学法检测到Bax、Fas表达较对照组增强,Bcl-2表达减弱(P<0.01)。结论:Ply可诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡,诱导凋亡的机制可能是通过死亡受体/Fas途径和线粒体途径双重机制的介导实现。
- 董姗姗王虹贺潇李忱伟董杰姜慧袁军何於娟李岱容
- 关键词：RAW264.7细胞凋亡线粒体途径
- 肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究
- 2010年
- 目的 构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）溶血素基因（pneumolysin,ply）缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）技术将ply基因替换为红霉素耐药基因（erm）后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功 单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响 但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间（6 h）明显晚于野生菌株（2 h）,且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01） 小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷 ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭.
- 李忱炜袁军王虹贺潇董杰崔瑾姜慧张雪梅胥文春何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素毒力
