国家自然科学基金(30872371)
- 作品数：7 被引量：17H指数：3
- 相关作者：杨琨孙元杰魏玉英陈琨金伯泉更多>>
- 相关机构：第四军医大学延安大学陕西师范大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 以肿瘤抗原BAP31为靶点的基因疫苗构建及其诱导小鼠免疫反应的研究被引量：3
- 2009年
- 目的:构建重组表达载体P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗并接种小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法:利用分子克隆技术,构建重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31,同时构建P-BAP31/EGFP和P-L-BAP31/EGFP重组质粒,并将其以脂质体瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31免疫C57BL/6小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测免疫脾细胞在受到BAP31抗原刺激后产生IFN-γ和IL-4细胞因子的频率;通过乳酸脱氢酶(LDH释放)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答。结果:酶切及测序结果表明,成功构建了针对BAP31肿瘤抗原的P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗。通过荧光显微镜观察重组质粒转染的HeLa细胞,可见EGFP报告基因表达的绿色荧光。ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价发现,带LAMP组明显高于不带LAMP组(P<0.05),且两者均高于空质粒(P-LAMP)及正常对照(N)组(P<0.01)。ELISPOT检测脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率,带LAMP组与其他组相比显著提高(P<0.01)。LDH释放试验显示,带LAMP组的特异性CTL活性高于不带LAMP组,且均高于对照组(P<0.01)。结论:构建了针对肿瘤抗原BAP31的全长基因疫苗,以其免疫C57BL/6小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫反应,其中,P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31。
- 宋朝君孙元杰魏玉英张赟欧阳清陈琨金伯泉杨琨
- 关键词：基因疫苗ELISPOT
- Th22细胞新型T细胞亚群研究进展被引量：3
- 2010年
- 在不同的CD4^＋Th细胞亚群中，Th17细胞介导的免疫应答在炎性疾病发生中起着重要的作用，这是由于Th17细胞免疫反应失调可诱导多种炎症反应而致自身免疫性疾病的发生，如银屑病、慢性特异性皮炎拉。Th17细胞产生的多种细胞因子（如IL-17、IL-22、IL-6等）参与多种炎症反应和自身免疫性疾病的发生发展。
- 陈琨杨琨
- 关键词：TH22细胞IL-22银屑病伤口愈合
- 基于光诱导荧光的维生素K1检测方法研究被引量：6
- 2014年
- 建立一种灵敏度高、选择性好的基于紫外光诱导荧光的维生素K1（VK1）检测方法.不发荧光的VK1经紫外光（254 nm,15 W）照射后可转变为具有很高荧光量子产率的光化产物,检测出其特征荧光峰在465nm处;当加入咪唑并经光诱导后,光化产物荧光特性发生变化,在330 nm处又出现一新的较强荧光发射峰,两峰间的stokes位移长达135 nm.同时发现,随着VK1浓度的增加,465 nm处的荧光峰强度增加,而330 nm处的峰强度反而减小.方法的检出限为0.003 μg· mL-1（S/N=3）,对1.0 μg·mL-1VK1溶液进行11次平行测定,相对标准偏差（RSD）为2.4％.该法用于注射液及人血清中VK1含量测定,回收率为97％～104％,结果令人满意.
- 李云云章竹君马红燕
- 关键词：荧光咪唑维生素K1血清注射液
- 截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定
- 2011年
- 目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。
- 李海涛宋朝君孙元杰魏玉英李永明刘飞刘志佳张葵金伯泉杨琨
- 关键词：GST融合蛋白蛋白表达
- 维生素K1的快速高通量光诱导化学发光分析被引量：4
- 2014年
- 基于物质的光化学诱导效应，建立了维生素K1的快速高通量光诱导化学发光分析法。不发荧光的维生素K1（VKl）经紫外光照射（15W／254nm）后转变为具有很高荧光量子产率的光化产物，进而使用双（2，4，6．三氯苯基）草酸酯（TCPO）-过氧化氢（H2O2）-VKl光化产物这化一学发光体系，测定其化学发光强度。实验对光化条件和化学发光条件分别进行优化，同时研究了咪唑对光化产物结构及其相应的光化产物化学发光机理的影响。结果表明：在优化实验条件下，光诱导化学发光强度与VKl质量浓度在0.007～3.333μg·mL。范围内呈良好的线性关系，方法检出限（S/N=3）为2.2ng·mL-1，对0.1μg·mL-1VKl溶液进行11次平行测定，得相对标准偏差（RSD）为2.7％，10min内可完成96个样品的快速测定。用于维生素Kl注射液及人血清中VKl含量的测定，回收率为96.0％～104.0％。该法灵敏度高、选择性好、试剂用量少、自动化程度高，特别适于高通量、大批量样品的快速分析。
- 李云云章竹君张琰图
- 关键词：维生素K1高通量化学发光人血清
- 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脾脏和肝脏中NKT细胞调变的研究被引量：1
- 2009年
- 目的:观察NKT细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脾脏和肝脏中所占百分比的变化特点,探讨NKT细胞在EAE模型中的免疫调节作用。方法:以MOG35-5521肽诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型并进行临床评分。于发病高峰期处死小鼠,分离脾脏和肝脏淋巴细胞,采用免疫荧光染色和流式细胞术(FCM)分析,观察EAE小鼠与正常小鼠脾脏和肝脏中NKT细胞在全部淋巴细胞中所占百分率的变化。结果:在EAE小鼠不同器官中,NKT细胞占淋巴细胞的百分率均较正常小鼠减少。脾脏NKT细胞百分率(%)从正常组2.22±0.14下降到EAE模型组1.94±0.07(P<0.05),肝脏NKT细胞百分率(%)从正常组5.52±2.17下降到2.67±1.41(P<0.05)。结论:NKT细胞在EAE模型C57BL/6小鼠脾脏和肝脏中增殖受抑,提示EAE发病可能通过对NKT细胞数量的调节进而影响其对免疫应答的调节。
- 欧阳清陈琨王曦张春梅郭俊魏玉英孙元杰徐竹蔚杨琨
- 关键词：NKT细胞EAE免疫调节
- 截短型肿瘤抗原BAP31 DNA疫苗的构建及免疫效果分析
- 2009年
- 目的:通过LAMP分子的靶向作用,增强截短型BAP31肿瘤抗原(BAP31)的MHC-II提呈,激活更多的特异性CD4+T细胞,最终辅助增加CTL细胞的杀伤活性及特异性抗体产生.方法:构建重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31,同时构建重组质粒P-△AP31/EGFP和P-L-△AP31/EGFP.质粒P-△AP31/EGFP和P-L-△AP31/EGFP瞬时转染Hela细胞,荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;ELISPOT检测免疫脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率;乳酸脱氢酶释放法检测免疫小鼠特异性CTL反应.结果:经酶切鉴定及序列测定,成功构建截短型肿瘤抗原BAP31的DNA疫苗重组载体;用带EGFP报告基因的重组质粒转染Hela细胞,荧光显微镜观察可见特异性的绿色荧光;ELISA检测免疫小鼠血清,带LAMP组BAP31特异性抗体效价明显高于不带LAMP组(P<0.01),且两者均高于空质粒及正常对照组;ELISPOT检测分泌IFN-γ,IL-4的T细胞频率,带LAMP组明显增高(P<0.01);杀伤试验表明,特异性CTL活性带LAMP组较不带LAMP组显著提高,且均高于对照组(P<0.01).结论:构建的P-△AP31和P-L-△AP31基因疫苗不仅在小鼠体内均可诱导特异性体液和细胞免疫应答,而且P-L-△AP31基因疫苗的免疫效果显著优于P-△AP31,为进一步研制肿瘤治疗性基因疫苗奠定了基础.
- 孙元杰宋朝君魏玉英张贇金伯泉杨安钢杨琨
- 关键词：疫苗DNA酶联免疫斑点试验
