南充市应用技术研究与开发资金项目(11A0115)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 相关作者：罗栩伟韩小伟冯刚陈竹白亦光更多>>
- 相关机构：南充市中心医院川北医学院泸州医学院更多>>
- 发文基金：南充市应用技术研究与开发资金项目国家自然科学基金四川省科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒被引量：4
- 2014年
- 目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人生长分化因子-5(GDF-5)基因重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法将PCR获取的GDF-5基因插入到质粒pMD19-T中,基因测序鉴定后将目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,HindⅢ酶切鉴定。重组质粒经PmeⅠ酶切使之线性化并去磷酸化处理,电转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,卡那霉素筛选,HindⅢ酶切鉴定阳性克隆,扩增重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒Ad-GDF-5,分别采用Western blot、TCID50法对Ad-GDF-5进行蛋白鉴定和滴度测定。结果经PCR扩增得到的GDF-5大小约为1.7kb,基因测序结果证实该基因与GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CMV-GDF-5、pShuttle-CMV-GDF-5-AdEasy-1经HindⅢ酶切后均得到大小约为1.7kb的片段,与GDF-5大小相符。Western blot证实Ad-GDF-5感染HEK293细胞后大量表达成熟GDF-5蛋白。研究结果表明成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体,并制备出5.6×109 PFU/mL的重组腺病毒。结论利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5,为进一步研究GDF-5的生物学功能及其相关疾病的基因治疗奠定了基础。
- 罗栩伟罗栩伟陈竹刘康韩小伟陈竹冯刚
- 关键词：腺病毒科生长分化因子-5基因治疗
- 椎间盘组织工程学髓核种子细胞的研究新进展被引量：3
- 2013年
- 椎间盘退行性变是临床的常见病,其病因尚不明确,可引起的一系列疾病如腰椎间盘突出症、颈椎病、椎间盘源性疼痛、椎管狭窄症以及脊柱节段不稳等,是导致腰腿痛和影响患者生活质量的常见原因之一。目前临床上的各种治疗办法或多或少存在着许多难以克服的问题,随着椎间盘髓核细胞组织工程学研究的不断深入,为椎间盘退行性变的治疗带来了新的希望,但其种子细胞的来源和鉴定等方面仍有许多问题亟待解决。
- 杨泽龙冯刚
- 关键词：椎间盘退行性变髓核细胞干细胞
- 人退行性变髓核细胞体外分离培养及鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的观察体外分离培养的人退行性变髓核细胞形态学表现,并分析其生物学特性。方法收集人退变髓核组织,胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞行平面培养并传代,倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,并分别在1w、2w、3w三个时间点通过硫酸化的糖胺聚糖含量测定、免疫组化染色、Safranin-O染色、Real-time PCR对髓核细胞进行生物学特性分析及鉴定。结果髓核细胞呈星形、多角形、梭形,部分胞浆突起,伸出伪足,与软骨样细胞形态相近,传代后细胞形态体积较原代大。髓核细胞能合成大量硫酸化的糖胺聚糖,细胞中富含蛋白多糖、Ⅱ型胶原,免疫染色呈阳性,随着培养周数的增加,其着色深度无明显强化。Safranin-O染色将细胞核染成红色,胞浆淡染,随着培养日期的延长,其红色强度无明显加深。Real-time PCR检测到Aggrecan、CollagenⅡ两基因在1w、2w、3w均持续稳定的表达,各观察点间无统计学差异(P>0.05)。结论胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法操作简单,培养效率高,传代培养的髓核细胞增殖速度快,经鉴定具有典型的类软骨细胞表征及良好的生物学特性,能持续稳定的表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原。
- 罗栩伟李艳刘康冯刚陈竹
- 关键词：髓核细胞生物学特性
