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甲基对硫磷水解酶参与催化相关结构的研究被引量：1: 2005年; 甲基对硫磷水解酶(MPH)是一种新的有机磷水解酶。将完整的甲基对硫磷水解酶基因(mpd)构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在EscherichiacoliDH5α中表达并得到了纯化。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂1,10菲啉的影响;但用电感耦合等离子发射光谱测定其金属含量显示MPH是金属酶,1mol酶中结合了2mol的Zn2+。为确定参与MPH催化活性的必需氨基酸,用化学修饰剂碳化二亚胺、二乙基焦磷酸酯、磷酸吡哆醛和丁二酮处理MPH,然后检测其残余酶活力,结果表明天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与酶的催化活性无关;而二乙基焦磷酸酯对组氨酸侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度的下降,其对酶活性的抑制率达到9.6h-1,说明组氨酸是酶活力所必需的基团。这些结果为进一步研究酶的结构及对酶进行分子改造提供了必要的基础数据。; 吴旭平刘卫东曹慧李顺鹏崔中利; 关键词：甲基对硫磷水解酶化学修饰必需氨基酸

重组有机磷水解酶MPH的发酵条件的优化研究被引量：2: 2007年; 有机磷水解酶在去除有机磷农药残留中具有重要的应用前景。在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了有机磷水解酶(MPH)的重组诱导表达之后,为了实现工业化生产MPH,考察了以乳糖为诱导剂,碳源、氮源、金属离子、培养温度、乳糖浓度及诱导时间等对产酶的影响,得到了优化的发酵条件,L9(34)正交实验进一步确定了最佳的碳源、氮源及乳糖浓度。在此基础上利用7L自控发酵罐进行了发酵过程研究,经12h培养,得到菌体12.65g(DCW)/L,MPH表达量为14.56%,酶活18.69I U/mL。; 林恒赵晓丽刘卫东曹慧李顺鹏崔中利; 关键词：甲基对硫磷水解酶乳糖正交实验

利用枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因被引量：6: 2006年; 用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N和去除了信号肽编码序列的成熟mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。用该探针从质粒pMPDP3和pMPDP29上克隆来自于枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因上游的启动子功能片段,构建了穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将表达载体pNYTM和pNYWM转入枯草芽孢杆菌1A751获得表达菌株1A751(pNYTM)和1A751(pNYTM),mpd基因在ytkA和ywoF基因的启动子和信号肽的带动下实现了分泌表达且具有天然活性,结果表明ytkA基因的启动子强度强于ywoF基因的启动子。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽编码序列构建了新的穿梭分泌表达载体pYNMK,并使mpd基因在枯草芽孢杆菌WB800中得到了更高水平的分泌表达,表达菌株WB800(pYNMK)在培养到第84h时甲基对硫磷水解酶酶活达到最高值为10.40u/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的10.8倍,重组表达产物有91.4%分泌在培养基中。; 张晓舟闫新崔中利李顺鹏; 关键词：枯草芽孢杆菌启动子信号肽分泌表达

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究被引量：15: 2004年; 用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因 ,构建了重组表达质粒pET2 9a_mpd ,将其转化至EscherichiacoliBL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,得到C 末端含有 6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶 ,用Ni NTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时 ,最适pH8 6～ 8 8,最佳反应温度 1 5℃ ;Mn2 + 、Zn2 + 、Cu2 + 可使酶活性增加 1 5 %～ 2 0 % ,Ca2 + 、Mg2 + 微弱地促进酶的作用 ,Ni2 + 对酶活性几乎无影响 ;1mmol LEDTA·Na2 + 几乎不影响酶的活性 ,而 1 0mmol LEDTA·Na2 + 对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时 ,最适pH8 6。 2 5℃时 ,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km 为 (6 8 6± 5 1 ) μmol L ,kcat为 (4 5± 6 )S- 1 ;对乙基对硫磷的米氏常数Km 为 (5 9 5± 6 0 )μmol L ,kcat为 (8± 1 )S- 1 。kcat Km; 傅国平崔中利徐玮吴旭平李顺鹏; 关键词：甲基对硫磷水解酶基因表达酶活性

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国家自然科学基金(30300005)