Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry(98H038)
- 作品数：75 被引量：335H指数：14
- 相关作者：成军刘妍王建军纪冬杨倩更多>>
- 相关机构：解放军第302医院北京地坛医院西安交通大学医学院第一附属医院更多>>
- 发文基金：Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry国家自然科学基金“九五”国家科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因被引量：1
- 2004年
- 目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白 (HBxAg)反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因 ,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA3 1( ) XTP4 ,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒pcDNA3 1( ) XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究 ,将富集的二次PCR产物与T/A载体连接 ,并转化大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到 2 1个阳性克隆 ,PCR分析显示其中 16个克隆含有 2 0 0～ 10 0 0bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析 ,结果共获得 9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因 ,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。
- 韩萍刘妍成军李莉朱传琳吴勤
- 关键词：X蛋白反式激活抑制性消减杂交
- 应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因被引量：5
- 2004年
- 目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建膦甲酸钠 (PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库 ,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因 ,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞 ,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照 ;2 4h后制备细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到 4 6个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 2 0 0～ 1 0 0 0bp插入片段。挑取含有插入片段的 1 4个克隆进行测序 ,并通过生物信息学分析获得 1 1种已知基因序列和 3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库 。
- 刘妍成军陆荫英王刚王建军张喜全王祥建
- 关键词：膦甲酸钠免疫调节抑制性消减杂交基因克隆
- 乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究被引量：7
- 2004年
- 目的 :应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 :以HBV前 S1蛋白表达质粒 pcDNA3 1( -) pre S1转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 S1反式激活作用的新的靶基因。结果 :对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前 S1反式激活蛋白 2 (PS1TP2 ) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6673。PS1TP2基因的编码序列全长为 5 73个核苷酸 (nt) ,编码产物由 190个氨基酸残基 (aa)组成。结论 :HBV前 S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用 ,最近的研究表明前 S1蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。HBV前 S1反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前
- 郭江成军纪冬赵龙凤王建军刘妍刘蔚
- 关键词：乙型肝炎病毒前-S1蛋白基因克隆化
- 基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA多聚酶RNase H反式调节基因被引量：3
- 2005年
- 目的:应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术,检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶RNaseH结构域蛋白(HBVDNAP RNaseH ,RNaseH)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明RNaseH对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法:以常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA 3 1(-) RNaseH ,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空白表达载体pcDNA 3 1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果:RNaseH表达质粒转染的细胞有2 2 2条差异表达基因,其中113条基因表达水平上调,10 9条基因表达水平下调。结论:应用基因芯片成功筛选了RNaseH转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明RNaseH的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。
- 陈国凤王琳成军张健刘妍刘敏张玲霞李莉
- 关键词：基因表达谱芯片技术DNA多聚酶反式调节基因反式激活作用
- 丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究
- 2004年
- 目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白 (core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcD NA3 1(- ) core转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1(- )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因 ,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染 pcDNA3 1(- ) core的HepG2细胞提取总RNA ,以RT PCR技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 2 0 0 1nt,编码产物由 6 6 7aa组成 ,并测序证实 ,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册 ,注册号为AY0 3835 9。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1。
- 刘妍王建军成军杨倩纪冬王春花党晓燕张玲霞
- 关键词：核心蛋白
- 双环醇下调细胞周期素B2基因启动子转录活性研究被引量：4
- 2005年
- 目的探讨双环醇对细胞周期素(cyclin)B2启动子转录活性的调节作用。方法根据文献报道的结果确定细胞周期素B2的启动子DNA序列区域,以聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素启动子(B2p),克隆至真核报告载体pCAT3Basic中,构建pCAT3cyclinB2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性并与双环醇共刺激的HepG2细胞,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得细胞周期素B2启动子的止确克隆。pCAT3cyclinB2p和双环醇(106Mol/L)瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3Basic空载体的2.4倍,pCAT3cyclinB2p的0.35倍。结论细胞周期素B2启动子有顺式激活下游基因的活性,双环醇具有对细胞周期素B2基因有下调作用。
- 郭江纪冬成军高学松吴顺华邵清刘妍罗金兰培
- 关键词：双环醇基因启动子下调
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究被引量：45
- 2003年
- 应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。
- 刘妍陆荫英成军王建军李莉张玲霞
- 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活克隆化
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究被引量：3
- 2004年
- 目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中有新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcD NA3.1( ) NS5A的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 15 72nt,编码产物由 5 2 4aa组成 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 936 4。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合 ,发现并鉴定、克隆了HCVNS5A反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3。
- 刘妍杨倩成军王建军纪冬王春花党晓燕张玲霞
- 关键词：丙型非结构蛋白NS5A反式激活基因克隆化
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究被引量：18
- 2003年
- 聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。
- 刘妍成军牟劲松陆荫英王建军李克王琳张玲霞
- 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活
- 应用基因表达谱芯片技术研究膦甲酸钠处理Jurkat细胞后的差异表达基因
- 2004年
- 目的 筛选膦甲酸钠处理人T淋巴细胞系Jurkat细胞后的差异表达基因。方法 应用基因表达谱芯片技术对膦甲酸钠处理的Jurkat细胞和以生理盐水处理的相同细胞的mRNA进行检测。结果 Jurkat细胞经膦甲酸钠处理后 ,所检测的 115 2条目的基因中 ,有 94条产生差异表达 ,其中 38条基因表达增强 ,5 6条基因表达降低。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了膦甲酸钠处理淋巴细胞后差异表达基因 。
- 刘妍成军王刚陆荫英王建军张喜全王祥建
- 关键词：膦甲酸钠免疫调节基因表达谱芯片
