湖南省卫生厅科研基金(B2003-085)
- 作品数：5 被引量：18H指数：3
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- 梅毒螺旋体融合双价DNA疫苗的构建及其免疫活性研究被引量：13
- 2006年
- 目的构建含有梅毒螺旋体Gpd和Tp92抗原编码基因的真核表达重组体,并检测其在兔体内的免疫应答效果。方法定向克隆构建双基因融合真核表达重组体pcDNA3．1(+)/Gpd-Tp92,用免疫组化技术检测其在HeLa细胞中的表达；同时将其与先期构建的pcDNA3．1(+)/Gpd、pcDNA3．1(+)/Tp92真核表达重组体分别免疫新西兰兔,ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IFN-γ诱导水平,MTT法检测兔脾细胞增殖水平。结果pcDNA3．1(+)/Gpd-Tp92在HeLa细胞中能有效表达。新西兰兔分别接种3种核酸疫苗后,均能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度均可达1∶1024及以上,免疫后兔脾细胞受相应蛋白刺激有明显增殖反应,细胞培养上清中IFN-γ水平显著升高。检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P＜0．05)。3组核酸疫苗组抗体诱导水平差异无统计学意义,但Gpd-Tp92融合核酸疫苗组刺激机体引发特异性淋巴细胞增殖能力较之两单基因核酸疫苗组有明显提高。结论梅毒螺旋体真核表达重组体pcDNA3．1(+)/Gpd-Tp92的成功构建及对新西兰兔产生强特异免疫应答的有效刺激,为梅毒DNA疫苗的研究奠定一定的实验基础。
- 赵飞骏吴移谋张晓红刘双全杨胜辉余敏君
- 关键词：抗体生成
- 梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定
- 2005年
- 目的构建梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因(Gpd)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gpd,鉴定其在Hela细胞的表达,为开展Tp DNA疫苗动物实验打下基础。方法用PCR从Tp Nichols株基因组中扩增Gpd基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gpd,脂质体介导转染入Hela细胞,以免疫组化及Western-blot检测在Hela细胞中的表达。结果双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1 059 bp的目的基因片段,读码框架正确,无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41 kDa的目的蛋白,重组蛋白能与梅毒螺旋体阳性血清反应。结论构建的质粒pcD-NA3.1(+)-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。
- 张明赵飞骏张晓红刘双全
- 关键词：梅毒螺旋体DNA疫苗真核表达
- 梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd的基因型分析及其重组蛋白的免疫原性鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的 构建梅毒螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)外膜蛋白Gpd基因的原核表达载体 ,检测其表达产物的免疫原性 ,并比较梅毒螺旋体各菌株Gpd基因序列的同源度。方法 从TpNichols株基因组模板中PCR扩增Gpd基因 ,与GenBank登录的序列做blast比较 ,定向克隆构建原核表达重组体pET2 8b( + ) -Gpd ,转入大肠杆菌ril表达菌 ,SDS -PAGE分析重组蛋白的表达 ,Western -blot检测重组蛋白的免疫原性。结果 载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Gpd基因序列完全一致 ,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 98%～ 1 0 0 %。SDS -PAGE检测诱导产物显示有一Mr约为 41kDa的特异蛋白带 ,免疫印迹技术检测其能与梅毒阳性标准血清反应。结论 Tp原核表达重组体pET2 8b( + ) -Gpd成功构建 ,且能够在ril表达菌中融合表达 ,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的实验基础。
- 严加林吴移谋赵飞骏刘双全
- 关键词：梅毒螺旋体原核表达
- 梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd基因的克隆、表达及其免疫活性研究被引量：10
- 2005年
- 利用PCR技术从Tp Nichols株基因组模板中扩增梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)外膜蛋白Gpd基因,定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd,免疫印迹和免疫组化技术检测pcDNA3.1(+)-Gpd在HeLa细胞中的表达;同时将真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd免疫新西兰兔,检测其在兔体内的免疫应答效果。免疫印迹和免疫组化鉴定均显示重组体在HeLa细胞中能有效表达一个41kD的Gpd融合蛋白。新西兰兔接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度可达1∶1024,免疫后兔脾细胞受Gpd蛋白刺激有明显增殖反应。所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖情况均显著高于空质粒对照组和空白对照组(p<0.05)。Tp真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd的成功构建及能刺激新西兰兔产生较强特异的免疫应答,为Gpd蛋白生物学功能及梅毒DNA疫苗的深入研究奠定了一定的实验基础。
- 赵飞骏吴移谋张晓红刘双全余敏君
- 关键词：梅毒螺旋体真核表达免疫
- 梅毒螺旋体膜蛋白Tp92真核表达重组体的构建及其表达鉴定被引量：1
- 2005年
- 目的 以梅毒螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)外膜蛋白基因Tp92为目的基因 ,构建Tp真核表达重组体pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,并鉴定其在Hela细胞能否正确表达 ,为进一步开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。 方法 应用PCR技术从TpNichols株基因组模板中扩增Tp92基因 ,定向克隆构建真核表达重组体 pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,脂质体介导将 pcDNA3 .1(+ ) -Tp92转染入Hela细胞 ,以免疫酶标法和一步法RT -PCR检测pcDNA3 .1(+ ) -Tp92在Hela细胞中的表达情况。 结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建Tp真核表达重组体pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,DNA测序显示重组质粒含有 2 10 3bp的目的基因片段 ,读码框架正确 ,无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较 ,载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Tp92基因序列完全一致 ,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 95 .5 %～ 10 0 % ,证实本研究所得到的基因为所需基因 ,同时也表明该基因为Tp的保守性基因。免疫酶标法结果显示该重组体在Hela细胞能有效表达目的蛋白与梅毒阳性标准血清中相应抗体反应 ;RT -PCR检测结果显示RT -PCR扩增产物与Tp92基因片段大小相符 ,确实源于重组质粒转录后的mRNA。
- 赵飞骏吴移谋刘双全余敏君
- 关键词：梅毒螺旋体DNA疫苗真核表达
