国家自然科学基金(30500436)
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
- 相关作者：邹全明马颖毛旭虎易勇张卫军更多>>
- 相关机构：第三军医大学更多>>
- 发文基金：军队杰出人才基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- EHECO157∶H7志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的基因克隆、表达与纯化被引量：5
- 2006年
- 目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin2B,Stx2B),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b,经测序鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,以Tricine-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2b基因约210bp;原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coliBL21(DE3)中得到高效可溶性表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约7×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达90.1%。结论EHEC O157∶H7志贺样毒素B亚单位的高效表达与初步纯化,有利于进一步的生物学性质研究。
- 马颖毛旭虎邹全明易勇程建平曾明张卫军
- 关键词：基因克隆原核表达纯化
- 抗Stx2B单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达被引量：3
- 2006年
- 目的构建重组志贺样毒素亚Ⅱ结合亚单位(Stx2B)单链抗体基因,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法借助连接肽(Gly4Ser)3将已成功扩增的抗Stx2B单抗1A5轻、重链可变区基因(VL、VH)连接成单链抗体(ScFv)基因VH-Linker-VL,并在VH5′端和VL3′端引入SfiⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至经改造的分泌性表达载体pCANTAB6His之中,转化EcoliHB2151,IPTG诱导表达。亲和层析纯化抗体蛋白后,以SDS-PAGE、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实基因构建正确。SDS-PAGE、ELISA分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物的相对分子质量(Mr)为27 000,与理论预期值相符,且可与相应抗原特异结合。结论成功实现了抗Stx2B单链抗体的原核分泌表达,为探讨O157菌的感染机制及防治研究奠定了基础。
- 马颖毛旭虎李海霞邹全明
- 关键词：志贺样毒素单链抗体分泌表达
- EHEC O157：H7志贺样毒素Ⅱ(Stx2)的克隆表达与活性研究
- 2006年
- 目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7志贺样毒素Ⅱ（ShigaliketoxinⅡ,Stx2）,并鉴定其生物学活性.方法 采用PCR法自EHEC O157：H7基因组扩增志贺样毒素Ⅱ的编码基因stx2,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c（＋）-stx2,经测序鉴定后转化E.col iBL21（DE3）,IPTG诱导表达,以SDS-PAGE、Western blot分析目的蛋白的表达.以EHEC O157：H7野生菌株作对照,通过对HeLa细胞的细胞毒作用及对小鼠攻毒实验,鉴定重组蛋白的生物学活性.结果 扩增的stx2基因约1230bp;原核表达质粒pET-11c（＋）-stx2经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli BL21（DE3）中得到表达,蛋白表达率约25%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约72×10^3;重组蛋白Stx2对HeLa细胞具有细胞毒作用,CD50为35 pg/ml;Stx2对小鼠致死剂量LD100为10μg.结论 成功克隆并表达了Stx2重组蛋白,为探讨O157：H7菌的感染机制及其防治研究奠定了一定的基础.
- 马颖毛旭虎邹全明易勇
- 关键词：基因克隆原核表达
