国家教育部博士点基金(20070678002)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 相关作者：詹辉王剑松王春晖王文举徐鸿毅更多>>
- 相关机构：昆明医学院第二附属医院中国医学科学院北京协和医学院中国科学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金云南省科技厅科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价被引量：1
- 2011年
- 凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1∶243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。
- 王春晖王剑松王文举詹辉李鸿钧颜汝平徐鸿毅
- 关键词：VP3蛋白多克隆抗体膀胱肿瘤腺相关病毒
- 凋亡素重组腺相关病毒的构建及体外抑制膀胱癌效应
- 2012年
- 目的探讨携带凋亡素基因的重组腺相关病毒构建方法，观察其体外抑制膀胱癌的效应。方法构建重组质粒pAAV-VP3，经EcoRI/SalI双酶切鉴定和基因测序无误后，采用三质粒共转染法包装重组腺相关病毒rAAV—VP3。收获病毒后聚合酶链反应（PCR）扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒，对其进行纯化后透射电镜观察病毒颗粒，并检测病毒滴度。按每个细胞5×10^5个载体基因组的剂量感染EJ细胞后，逆转录（RT）-PCR检测VP3基因在EJ细胞中的转录，Westernblot法检测凋亡素蛋白的表达。透射电镜扫描观察感染重组病毒后肿瘤细胞的超微结构变化，流式细胞术（FCM）检测重组病毒对EJ细胞的影响。结果转染72h后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功，滴度为5．1×10^11个载体基因组／ml，电镜下可见病毒颗粒。感染EJ细胞后，可检测到VP3基因的转录和凋亡素蛋白表达，电镜观察到凋亡形态学改变，FCM检测S期细胞比例降低和G2／M期细胞比例增高，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论重组腺相关病毒rAAV—VP3在体外能够发挥生物学活性，其介导的凋亡素表达抑制膀胱癌的体外效应为体内实验奠定了基础。
- 王春晖王剑松王文举余力锐詹辉徐鸿毅
- 关键词：VP3蛋白膀胱肿瘤
