河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A230837)
- 作品数：7 被引量：23H指数：3
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- 相关机构：新乡学院河南科技学院新乡市动物疫病预防控制中心更多>>
- 发文基金：河南省教育厅科学技术研究重点项目河南省基础与前沿技术研究计划项目国家自然科学基金更多>>
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- 猪瘟病毒 E2蛋白的原核表达及鉴定被引量：1
- 2014年
- 以猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白为研究对象,通过扩增CSFV C株E2基因,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-E2,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDSPAGE检测表明与目的蛋白大小一致,其分子质量大小为67.0ku,并且目的蛋白以包涵体形式存在。Western blot表明,重组蛋白能与CSFV兔化高免血清反应并且能被GST标签单抗所识别,表明该融合蛋白正确表达,具有良好的抗原性,为CSFV抗体检测试剂盒的研究奠定了基础。
- 朱艳平郭东光岳锋李鹏尹创成银梅王选年
- 关键词：猪瘟病毒E2蛋白原核表达
- 猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化被引量：7
- 2016年
- 以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0μg/mL和1∶200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37℃1h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1∶10 000和37℃45min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。
- 冯春花朱艳平郭东光岳锋
- 关键词：猪瘟病毒E2蛋白间接ELISA抗体检测
- 猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及鉴定被引量：5
- 2014年
- 为获得猪瘟病毒(CSFV)E0重组蛋白,建立CSFV抗体快速检测方法。本研究通过扩增CSFV C株E0基因,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-2-E0,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE检测表明与目的蛋白大小一致,其分子质量大小为46ku。优化重组蛋白表达条件,最终获得诱导表达的最佳温度为37℃,最佳IPTG浓度为0.1mmol/L,并且目的蛋白以包涵体形式存在。Western blot表明,目的蛋白能与CSFV兔化高免血清反应,表明该融合蛋白具有良好的抗原性。本研究为CSFV抗体检测试剂盒的研究奠定了基础。
- 郭东光朱艳平孙国鹏岳峰贾文科王军李鹏王自浩王选年
- 关键词：猪瘟病毒蛋白
- 猪PD-1胞外区基因的克隆及原核表达
- 2015年
- 为研究PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制性疾病中的作用,根据猪的PD-1的基因序列,设计扩增其胞外区的引物,从猪PBMC基因组中通过PCR扩增获得猪PD-1胞外区基因片段,测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET32-PD1,转化大肠埃希菌DH5α。挑选可疑菌落鉴定正确后转至Rosetta(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,在37℃、0.5mmol/L IPTG条件下诱导获得33ku的PD-1胞外区融合蛋白,能够被其多抗血清、His标签抗体和人PD-1抗体所识别。本研究为制备其单克隆抗体和研究PD-1/PD-L1在猪免疫抑制性疾病中的作用提供了材料。
- 杨媛朱艳平岳锋孙国鹏张艳芳银梅王选年
- 关键词：胞外区克隆原核表达
- 猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定
- 2013年
- 为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法。本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1。重组表达质粒转化Rosetta(DE3)细胞,利用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物。结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应。获得CSFVNS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原。
- 刘卫朱艳平宁红梅银梅郭东光鲁毅王选年
- 关键词：猪瘟病毒抗原表位原核表达免疫印迹
- 猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：8
- 2014年
- 根据GenBank中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R2=0.999;敏感性高,最低检测限为1×101拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。
- 岳锋朱艳平银梅王选年
- 关键词：猪瘟病毒实时荧光定量PCRTAQMAN探针
- 鸡传染性支气管炎病毒S1基因抗原区的原核表达及鉴定被引量：2
- 2014年
- 本研究以鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1基因为研究对象,设计特异性引物扩增S1抗原集中区目的基因,长度为198bp,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-S1,转化至宿主菌Rosetta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达获得1条特异性蛋白条带,其分子质量大小为33.0ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以包涵体形式存在。Western blotting结果显示,重组蛋白能与IBV鸡阳性高免血清反应,被GST标签单抗识别,结果表明该融合蛋白正确表达并具有良好的抗原性。本研究为制备IBV单克隆抗体奠定了抗原基础。
- 朱艳平郭东光岳锋杨媛李冲王爱国李博文阮涛孔令芸王选年
- 关键词：鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白原核表达
