国家重点基础研究发展计划(2014CB542702)
- 作品数：9 被引量：12H指数：2
- 相关作者：马志永李蓓蓓魏建超邱亚峰刘珂更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所南京农业大学河南省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国家生猪现代产业技术体系建设项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒JX14T2毒株的分离与鉴定被引量：1
- 2016年
- 江西省某猪场育肥猪群出现高热、呼吸困难和死亡等症状,为确定疫病病原,本实验室从发病猪场随机采取20份病死猪血样和组织,用RT-PCR的方法进行病原检测.结果显示,19份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）阳性.随后对病死猪肺组织进行病毒分离,结果显示分离的第1代病毒感染后48 h即可出现典型的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,对传至第5代的病毒进行RT-PCR检测和间接免疫荧光鉴定,结果证实我们分离获得的病毒为PRRSV,命名为JX14T2.将JX14T2 P5代次的病毒与高致病性PRRSV强、弱毒代表株进行生长特性比较分析,结果显示,JX14T2在Marc-145细胞上形成的细胞病变、病毒噬斑形态以及病毒增殖动态均与HP-PRRSV毒株相似.对JX14T2进行全长基因测序和序列比较分析,结果表明JX14T2基因组全长14960 bp,属于北美型毒株,其NSP2除存在的1＋29个氨基酸的缺失而外,在598-717 aa还存在120个氨基酸的缺失,与HP-PRRSV亲缘关系较近.本研究结果为掌握PRRSV流行情况以及致病机制提供了科学依据.
- 王鑫杨德强张文超姜一峰虞凌雪杨莘高飞李丽薇黄勤峰童光志周艳君
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 猪血清淀粉样蛋白3分子SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：2
- 2017年
- 分别根据猪血清淀粉样蛋白3(serum amyloid A3,SAA3)基因序列以及猪三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因全长序列设计特异性扩增引物,进行PCR扩增,并将PCR扩增片段连接至相应载体上构建重组质粒。两个重组质粒经测序鉴定和纯化后,倍比稀释作为标准曲线样品,用于实时荧光定量PCR中SAA3、GAPDH标准曲线的制备,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性检测。结果显示,标准曲线线性关系R2均在0.98以上;特异性检测显示该引物可以特异性检测到猪SAA3、GAPDH扩增曲线;组内和组间变异系数均小于5%,说明本研究成功建立猪SAA3的荧光定量PCR检测方法。运用建立的荧光定量RT-PCR对正常以及感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的肺泡巨噬细胞和猪组织进行检测,可检测到猪SAA3的表达,正常组与接毒组之间显示出明显的表达差异。本研究初步建立了检测猪SAA3基因的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法,为后续对猪传染性疾病与猪SAA3之间相互关系的研究提供了一种特异、灵敏的检测方法。
- 郇贝丽刘珂马改妮魏建超邵东华李蓓蓓邱亚峰石元元马志永
- 关键词：SYBR
- 表达猪源GM-CSF蛋白的重组PRRSV构建及鉴定被引量：2
- 2014年
- 为提高猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)弱毒疫苗的免疫效果,本研究以高致病性PRRS弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆为基础,在NSP2区域删除了110个氨基酸,将猪源GM-CSF基因和PRRSV ORF6转录引导序列(TRS6)通过融合PCR方法插入HuN4-F112疫苗株的ORF1b和ORF2a之间,构建了全长重组质粒pHN4-△110-GM-CSF。将该重组质粒采用SwaⅠ酶切线性化,经体外转录病毒基因组RNA后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中进行病毒拯救及传代。结果显示重组病毒感染Marc-145细胞可以引起明显的细胞病变;经RT-PCR、DNA测序、MluⅠ酶切鉴定和免疫荧光鉴定结果显示,救获的重组PRRSV含有GM-CSF基因并能够有效表达,将其命名为rHN4-△110-GM-CSF。生物学特性分析表明重组病毒与亲本病毒在Marc-145细胞中具有相似的生长特性,插入的外源基因具有良好的遗传稳定性。由于GM-CSF能够活化树突状细胞,是一种良好的免疫佐剂。该重组病毒的构建为动物体内免疫保护攻毒试验评价奠定了基础。
- 虞凌雪周艳君姜一峰童武高飞夏天奇王康杨莘李丽薇程群童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒GM-CSF
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12蛋白的表达与鉴定被引量：1
- 2018年
- 本研究扩增了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Hu N4株的NSP12基因,将其克隆于pCold-Ⅰ载体中,获得重组质粒pCold-Ⅰ-NSP12,并转化于E.coli/BL21感受态细胞,在16℃条件下用1 mmol/L的IPTG诱导20 h后,用SDS-PAGE电泳检测表达产物,结果显示在大约18 kDa处出现目标蛋白。用PRRSV特异性阳性猪血清对表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示该蛋白可以被PRRSV阳性猪血清识别。将重组NSP12蛋白纯化后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。在MARC-145细胞中,对获得的NSP12多抗血清分别进行Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定,结果显示本研究制备的NSP12多抗血清均可与感染的MARC-145细胞的PRRSV Hu N4株以及在MARC-145细胞中特异表达的NSP12蛋白发生免疫反应。PRRSV NSP12蛋白的表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NSP12在病毒感染过程中的作用奠定了基础。
- 张文超张文超虞凌雪姜一峰高飞李丽薇李丽薇李慧春陈鹏飞杨德强刘欢童光志杜雅楠
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达多抗
- PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞IFITM3基因转录的影响
- 2018年
- 干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon inducible transmembrane proteins 3,IFITM3)作为抗病毒蛋白可以抑制多种病毒的感染,本研究针对猪IFITM3基因设计特异性引物,构建重组质粒并作为阳性标准品,建立了检测IFITM3基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法最低检出下限为10~2 copies/μL,且线性关系好(R^2≥0.997),敏感性高,特异性强,重复性好,批内、批间变异系数均小于3%。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)细胞,在不同感染时间对细胞中IFITM3 mRNA进行检测。结果显示,PRRSV感染早期IFITM3转录水平保持不变,在感染后转录水平逐渐升高。IFITM3 mRNA在PRRSV感染PAM过程中转录变化,可能是PRRSV宿主免疫逃逸的机制之一。
- 李玉明武专昌刘珂马改妮魏建超邵东华李蓓蓓邱亚峰石元元马志永
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR猪肺泡巨噬细胞
- PRRSV N蛋白抗原肽的预测、合成以及针对该抗原肽抗体的制备和应用被引量：1
- 2018年
- 基于生物信息学、化学合成技术和免疫学技术,利用预测的抗原肽进行抗体的制备已被广泛地应用。本研究探讨了利用预测的抗原肽制备针对PRRSV N蛋白的特异性抗体。首先,利用生物学软件对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白进行抗原性预测,获得一个位于蛋白N端16个氨基酸的候选抗原肽。通过BLAST比对,发现该抗原肽在不同北美型毒株中高度保守。其次,采用Fmoc固相法进行抗原肽合成,并将合成的抗原肽通过MBS法偶联到KLH载体蛋白上。随后,将偶联好的抗原肽与弗氏完全佐剂或不完全佐剂混合,免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并利用IgG亲和层析的方法纯化抗体。最后,利用ELISA、Western blot和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对抗体的特异性进行检测,结果显示,利用偶联好的抗原肽包被ELISA板,检测抗体的滴度,纯化抗体的滴度超过10~5;Western blot结果显示,该抗体(1∶2000)可以特异地识别PRRSV感染的Marc145细胞中的N蛋白,重要的是该抗体可以与不同毒株反应;IFA检测显示,该纯化的抗体(1∶100)可以检测PRRSV感染的细胞。因此,利用生物信息学软件预测的PRRSV N蛋白的抗原肽,能有效地应用于抗PRRSV N蛋白抗体的制备,制备的抗体不仅为研究PRRSV N蛋白奠定基础,而且为研究PRRSV与细胞相互作用提供了一个有效的工具。
- 相笑张彦兵石元元李玉明刘珂魏建超邵东华李蓓蓓童光志马志永邱亚峰
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白抗原肽抗体
- 猪2′,5′寡腺苷酸合成酶OAS1a基因克隆与序列分析及其在Marc-145细胞上对PRRSV复制的影响被引量：2
- 2018年
- 旨在探索猪2’，5’寡腺苷酸合成酶OASla对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRs）的复制是否有抑制作用，进而为探索抑制病毒复制寻求新的思路。从PAM猪肺泡巨噬细胞中克隆了猪2’，5‘寡腺苷酸合成酶OASln基因，将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3．1中，测序与序列分析之后将该基因转染Marc-145细胞，然后接种PRRSV病毒，与对照组比较病毒的抑制效果。结果显示，病毒的滴度明显下降，病毒的RNA水平也明显下降，由此推断猪2’，5，寡腺苷酸合成酶OAS1a可以在Marc-145细胞上抑制PRRS的复制。
- 赵孟孟张雅张雅陈静陈静罗雪刚刘迎琦黄晓静乔松林乔松林
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度MARC-145细胞
- ATP5J促进猪繁殖与呼吸综合征病毒复制研究
- 2018年
- 为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）复制与细胞调控酶ATP5J的关系,本研究首先对猪源ATP5J基因进行了抗原表位分析,选取并合成了3段抗原小肽,制备ATP5J的多克隆的抗体。用制备的多抗检测了ATP5J质粒在293T细胞中过表达的情况。然后,用PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）,利用qPCR和Western blot检测PRRSV感染对PAM细胞中ATP5J表达的影响。最后,我们通过小RNA干扰以及过表达ATP5J,使用qPCR和Western blot技术,在PAM和Marc-145细胞上检测ATP5J变化对PRRSV复制增殖的影响。结果显示：PRRSV感染能够导致宿主细胞ATP5J蛋白表达下调;ATP5J下调时,PRRSV复制减弱;ATP5J过表达时,PRRSV复制增强,说明ATP5J能够促进PRRSV复制增殖。进一步分析证明：ATP5J促进PRRSV复制功能没有剂量依赖性。综上,PRRSV感染能够导致宿主细胞ATP5J蛋白表达下调,而ATP5J具有促进PRRSV复制的作用。该研究为阐明PRRSV与宿主相互作用提供了新思路,为解析PRRSV免疫抑制和免疫逃逸机制奠定了基础。
- 王飞飞刘珂郇贝丽欧安妮魏建超李蓓蓓邵东华邱亚峰钱莺娟JUNG Yong-Sam马志永
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因调节病毒复制
- 猪源干扰素刺激基因PPBP荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：3
- 2018年
- 根据猪源干扰素刺激基因PPBP(pro-platelet basic protein)基因全长序列,使用引物设计软件Primer Premier5.0设计合成特异性引物,经过PCR扩增,将基因扩增的片段连接到相应的载体上,成功构建重组质粒p3XFLAG-CMV-7.1-PPBP。重组质粒经过筛选、鉴定以及纯化后,经10倍系列稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中PPBP标准曲线的构建,并检测重复性、灵敏性和特异性。结果显示标准曲线线性关系R2>0.99;特异性试验中也能检测到PPBP扩增曲线;组间和组内变异系数均小于5%。使用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测PRRSV感染组织和未感染组织中PPBP的表达情况,能够检测出组织中PPBP的含量存在差异。本研究初步建立了检测猪PPBP基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为后续猪传染性疾病和猪PPBP之间相互关系的研究提供一个特异灵敏的检测和手段。
- 王飞飞王飞飞刘珂魏建超魏建超邵东华李蓓蓓邱亚峰石元元钱莺娟马志永
- 关键词：SYBR实时荧光定量PCR
