国家重点基础研究发展计划(2001CB510008)
- 作品数：29 被引量：104H指数：7
- 相关作者：梁智辉龚非力吴雄文翁秀芳王小宁更多>>
- 相关机构：华中科技大学南方医科大学华南理工大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。
- 张彩娥邓云华吴雄文梁智辉翁秀芳卢小玲夏芳珍钟茂华陆盛军
- 关键词：HLA-A2尖锐湿疣细胞毒性T细胞
- sHLA-A*020-1抗原肽复合物的构建被引量：4
- 2004年
- 以原核表达的sHLA A 0 2 0 1 BSP为重链 ,β2 m为轻链 ,与人工合成的EBV抗原肽LMP2A (4 2 6 4 34、NH2 CLGGLLTMV COOH )利用稀释法进行共折叠复性 ,形成可生物素化的可溶性HLA A 0 2 0 1抗原肽复合物。并利用仅与天然构象HLAI类分子结合的单抗W6 / 32 ,通过Dot ELISA和Westernblot对折叠产物的构象进行鉴定 ,证实复性后成功获得了天然构象的sHLA A 0 2 0 1 抗原肽复合物。为进一步组装可溶性HLA/抗原肽四聚体以及制备人工抗原提呈细胞奠定基础。
- 陈浩吴雄文梁智辉翁秀芳韩军艳黄亚非龚非力
- 关键词：稀释复性四聚体
- 土拨鼠肝炎病毒核心蛋白的高效表达和B细胞表位鉴定
- 2007年
- 目的建立高效表达土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHcAg)的方法并对其B细胞表位进行鉴定。方法分别构建不同截短型WHcAg的质粒以了解能大量表达并形成WHV核心颗粒的区段,利用变性WHcAg制备单克隆抗体以寻找能与WHcAg线性B细胞表位结合的单克隆抗体。结果WHcAg前144或149氨基酸残基能够大量表达并能形成颗粒样结构。这2种截短型WHcAg能够在大肠杆菌中表达并组装成直径为34 nm的核心颗粒,最终纯化获得毫克级的核心蛋白。截短型WHcAg保留了全长WHcAg的抗原性,而且变性WHcAg存在另外的B细胞线性表位,利用变性WHcAg进行免疫制备单克隆抗体获得的5株抗体均针对WHcAg的N末端表位,该表位在WHcAg和HBcAg高度保守。结论建立了高效表达WHcAg的方法,制备了针对WHcAg单克隆抗体。并对WHcAg的线性B细胞表位进行了鉴定,发现WHcAg和HBcAg的N末端存在共同的线性B细胞表位。
- 张振华田拥军李磊Melanie FiedleErnst SchmidMichael Roggendorf陆蒙吉徐飏杨东亮
- 关键词：土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体
- HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体的克隆及鉴定
- 2005年
- 目的 构建人HLA G5 IgGFc融合蛋白真核表达载体。方法 经重组PCR将HLA G5和IgGFc基因拼接并插 入T载体。鉴定后,双酶切得到融合基因并插入真核表达载体pcDNA3.1。结果 PCR、限制性内切酶酶切和序列分析表明 已构建pcDNA3.1 HLA G5表达载体。结论 成功构建了HLA G5 IgGFc段融合蛋白真核表达载体。
- 陈庆吴雄文杨敬宁梁智辉
- 关键词：真核表达载体HLA-GGFPCDNA3T载体克隆
- 原核表达、稀释复性的可溶性HLA-G1抑制混合淋巴细胞培养中T细胞增殖
- 2007年
- 目的：探讨原核表达体外稀释复性的可溶性人类白细胞抗原G1（soluble HLA-G1，sHLA-G1）对体外混合淋巴细胞反应中T细胞增殖的影响。方法利用原核表达的sHIA-G1的重链、轻链及人工合成的九肽，折叠形成正确构象的sHLA-G1．肽复合物；在混合淋巴细胞培养（MLC）体系中加入折叠所得的sHLA-G1-肽复合物及相同浓度的对照物，流式细胞仪检测T细胞的增殖情况。结果sHLA-G1．肽复合物加入到混合淋巴细胞培养中能够抑制T细胞的增殖，3个个体的抑制率分别为28．5％、32．5％及22．1％（Dunnett t检验，P〈0．05）；这种抑制作用可以被HLA-G特异性McAb（G11E5）所逆转。结论通过原核表达，体外稀释复性的方法可以大量制备正确构象的sHLA-G1-肽复合物，该复合物分子能够抑制混合淋巴细胞培养中T细胞的增殖。
- 夏芳珍钟茂华张彩娥陆盛军吴雄文梁智辉龚非力
- 关键词：T细胞增殖人类白细胞抗原G混合淋巴细胞反应
- 自身肽结合于HLA-A2分子上能够在体外诱导抗原肽特异性的同种T细胞被引量：1
- 2007年
- 在同种反应性T细胞(同种T细胞)识别的配体中,抗原肽的作用是免疫学长期争论的问题,即同种T细胞识别是否具有抗原肽特异性.为了证实通过长期混合淋巴细胞培养(LTMLC)方法能够诱生抗原肽/MHC复合物(pMHC)特异性的同种T细胞,本研究利用仅表达HLA-A2,TAP缺陷的T2细胞,将酪氨酸激酶来源的自身抗原肽(Tyr369-377)和EB病毒来源的病毒抗原肽(LMP2A426-434)分别加载到T2细胞上,使T2细胞提呈单一的T细胞抗原识别表位,并且选择4个HLA-A2阳性(HLA-A2+ve)与4个HLA-A2阴性(HLA-A2-ve)个体的PBL样本,与加载上述抗原肽的T2细胞混合培养.在此实验系统中,HLA-A2+ve PBL与加载病毒抗原肽的T2细胞(T2/LMP)混合培养代表T细胞对普通抗原的反应,而HLA-A2-ve PBL与加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)混合培养则为T细胞对同种抗原的反应.利用特异性pMHC四聚体染色与特异性细胞毒试验检测LTMLC诱生CTL的特异性,其中利用HIV抗原肽(Gag77-85)作为对照.结果显示:(ⅰ)T2/LMP与HLA-A2+ve个体的PBL混合培养产生CTL(CTL-T2/LMP),CTL-T2/LMP对T2/LMP的杀伤显著高于对照T2/HIV的杀伤(26.52%±3.72%vs7.01%±0.87%,P<0.001);LMP四聚体对CTL-T2/LMP染色的阳性细胞数显著高于对照HIV四聚体(0.98%±0.33%vs0.05%±0.01%,P=0.0014);(ⅱ)加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)可诱导HLA-A2-ve个体的PBL产生CTL(CTL-T2/Tyr),CTL-T2/Tyr对T2/Tyr的杀伤显著高于对T2/HIV的杀伤(28.07%±2.58%vs6.87±1.01%,P<0.001);Tyr四聚体对CTL-T2/Tyr染色的阳性细胞数显著高于HIV四聚体(0.88%±0.3%vs0.06±0.03%,P=0.0018).结果说明:结合于自身MHC分子上的病毒抗原肽与结合于同种MHC分子上的自身抗原肽都能诱导产生抗原肽特异性的CTL;在LTMLC诱生的同种CTL中,有相当数量的CTL具有pMHC特异性,这些同种CTL的识别机制与普通抗原反应性CTL一样,识别的对象也是特异性的pMHC.支持了同种抗原的pMHC种类繁多造成同种T细胞反应强度极高的假说.�
- 翁秀芳梁智辉卢小玲钟茂华陆盛军张彩娥邓靖吴雄文龚非力
- sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测被引量：1
- 2006年
- 目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证。结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。
- 翁秀芳吴雄文梁智辉蔡蕾费世江陈国安龚非力
- 关键词：生物素化抗原特异性CTL
- 小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响被引量：7
- 2006年
- 目的:研究可溶性小鼠CD83(mCD83)对树突状细胞(DC)表达共刺激分子及共刺激活性的影响。方法:克隆mCD83基因,构建mCD83胞外功能区与人IgG1αFc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg,并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白。采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达。用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系(DC2.4)采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响;采用混合白细胞培养试验,检测mCD83-hIg对DC2.4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响。结果:酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确;mCD83-hIg对DC2.4细胞周期和细胞凋亡无影响,但可下调DC2.4表面共刺激分子CD80和CD86的表达;mCD83-hIg处理过的DC2.4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降。结论:mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性,从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子。
- 徐军发黄保军熊平冯玮徐勇方敏郑芳龚非力
- 关键词：DC2.4共刺激分子共刺激作用T细胞增殖
- Expression of recombination-activating genes and T cell receptor gene recombination in the human T cell leukemia cell line被引量：9
- 2007年
- 背景最近的研究建议了成熟 T 房间能通过激活再结合的基因(破布) 和调停破布的 V (D) J 再结合的表示改变他们的特性。这进程被称为受体修订并且从转基因的鼠标和人的施主在成熟外部 T 房间被观察了。然而，在成熟 T 房间的受体修订是否是一个随机或面向的过程，仍然保持糟糕理解。这里，我们使用了 Jurkat 人的 T 房间线，它代表 T 房间开发的一个成熟阶段，作为一个模型，房间受体( TCR )基因 recombination.Methods TCR D-J 信号关节 T 房间受体切除 DNA 圆( sjTRECs )被决定调查 T 的规定由嵌套并且 seminested PCR 。在在 TCRV 链地点的再结合信号序列(RSS ) 的双海滨 DNA 裂缝被 ligation-mediated-PCR 检测。决定补充的区域的进一步的分析(CDR3 ) 3 TCRV 链缩放被 TCR GeneScan technique.Results RAG1， RAG2，和 nonhomologous DNA 的三个关键部件检验加入结束(NHEJ ) 小径乐意地在 Jurkat 被检测。D2-J2 信号关节和 ds RSS 裂缝的 junctional 差异的特征与 D25' 联系了， D 23' 地点从 Jurkat 房间在 DNA 被检测。TCRV 链的序列没在房间 proliferation.Conclusions RAG1 和 RAG2 和进行中的 TCR 基因再结合期间改变的 CDR3 尺寸和基因是在 Jurkat 房间的 coexpressed，但是进行中的再结合过程不能在 TCR 全部剧目的修正起一个作用。然而，结果建议 Jurkat 能作为一个模型被使用学习破布和 V (D) J 再结合并且作为 TCR 基因重新整理和“否定”的受体修订的共存的一个“特殊”的模型的规定。
- ZOU Hong-yunMA LiMENG Min-jieYAO Xin-shengLIN YingWU Zhen-qiangHE Xiao-weiWANG Ju-fangWANG Xiao-ning
- 关键词：T细胞
- 可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定被引量：2
- 2006年
- 目的合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链(β2m),在人工合成的HLA-G1限制性九肽(KGPPAALTL)存在的条件下,通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体(W6/32及兔抗人β2m抗体)进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验,检测稀释复性的折叠产物。结果折叠复合物含有35%可溶性HLA-G1-肽复合物、5%可溶性HLA-G1重链聚合体及60%复性的β2m3种成分。结论通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。
- 夏芳珍吴雄文钟茂华褚利霞翁秀芳张彩娥卢小玲梁智辉
- 关键词：MHCI类可溶性稀释复性
