国家自然科学基金(31101837)
- 作品数：22 被引量：122H指数：6
- 相关作者：唐青海刘长明危艳武吴洪丽王一平更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所南阳师范学院衡阳师范学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划河南省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备被引量：3
- 2017年
- 本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RTPCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体。结果表明,pELF4开放阅读框为1 989bp(GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。
- 王瑾唐青海谷雅静李晓楠李羽王雪雨姚伦广阚云超
- 关键词：原核表达免疫
- 猪肾细胞源三种蛋白质对猪圆环病毒2型复制的调节作用被引量：2
- 2015年
- 为了验证猪肾细胞系(PK-15)源3种蛋白质基因(AP2α2、Elf4和ISCU)表达水平对猪圆环病毒2型(PCV2)复制的调节作用,采用RT-PCR扩增这3种蛋白质编码基因,构建真核表达载体;同时设计这3种蛋白质的RNAi片段,分别插入到pGPU6-GFP载体构建shRNA干扰载体。以荧光定量PCR法检测干扰效率,选取干扰效率较高的干扰载体,利用G418筛选转染真核表达载体或干扰载体后的PK-15细胞。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)法检测PCV2LG毒株在这些细胞中的复制效率。结果表明,Elf4蛋白和ISCU蛋白基因过表达能够显著增强PCV2的复制;而AP2α2蛋白基因过表达对PCV2的复制无显著影响。AP2α2、ISCU和Elf4这3种蛋白质基因被干扰表达后均可降低PCV2复制效率,表明这3种宿主细胞蛋白质对该病毒复制具有调节作用。
- 张辉唐青海黄立平危艳武刘长明
- 关键词：猪圆环病毒2型ISCU
- 犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定被引量：1
- 2015年
- 犬细小病毒(CPV)编码的VP2基因容易发生变异,导致病毒嗜性和致病性的改变。为制备一株高致病性的CPV毒株(NY株,基因型为2a型)重组VP2蛋白,构建重组原核表达载体pET28a-CPVVP2,转化E.coli BL21(DE3)表达菌株,通过不同温度、不同IPTG浓度和不同诱导时间等条件的优化进行表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组CPV-NY毒株VP2蛋白(rVP2)的分子质量约为72ku,在不同温度条件下均以包涵体形式存在,在37℃条件下以终浓度为0.2mmoL/L IPTG诱导4h表达量达到最高。rVP2不仅与His标签mAb反应,也能与CPV特异性阳性血清反应,说明rVP2具有良好的反应原性,为CPV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗的研究奠定了基础。
- 毛倩倩卜宾唐青海阚云超姚伦广唐存多焦铸锦杨建伟
- 关键词：VP2原核表达
- 一例犬瘟热的诊疗报告
- 2018年
- 对一例疑似犬瘟热(CD)的病例进行诊断及治疗,分别采用胶体金试纸条检测、采用逆转录-聚合酶链式反应(R T-PCR)检测病原抗原和犬瘟热病毒(CDV)N基因序列分析。结果显示,病犬鼻分泌物经胶体金检测为CDV抗原弱阳性,RT-PCR产物大小为287 bp,此毒株N基因核苷酸序列与野毒株的核苷酸序列同源性高达96.5%~98.6%,遗传进化分析显示,该毒株与疫苗株(Onderstepoort、CDV3等)和Lederle等弱毒株不在同一分支上,而与野毒株在同一分支,说明该毒株为CDV强毒株,将此分离株命名为CDV-Hu NHY171124。采用中西结合的抗病毒治疗方案对病犬进行为期7 d的治疗,疗效不显著,病情恶化而接受安乐死。
- 廖慧唐青海彭光亮韩涛涛曾繁荣黎露吴思雯杨海易程
- 关键词：犬瘟热病毒胶体金RT-PCR
- 转录因子ELF4的免疫调节功能研究进展
- 2016年
- ETS（E26 transformation specific）家族分子是多细胞生物的一类转录因子，因最早在禽骨髓成红细胞增生症病毒E26所表达的融合蛋白中发现的癌基因编码的蛋白而得名。该家族蛋白结构高度保守，其中具有一段85aa序列能够特异性地结合于DNA共有基序GGAA／T。
- 唐青海彭永刚杨海王芳宇何丽芳唐姣玉
- 关键词：转录因子免疫调节功能多细胞生物基因编码细胞增生蛋白结构
- 与PCV2基因组茎环结构相互作用宿主细胞蛋白的筛选与鉴定
- 利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合...
- 张辉唐青海危艳武黄立平张志慧刘建波吴洪丽刘长明
- 关键词：猪圆环病毒2型茎环结构宿主细胞
- 文献传递
- 1株犬细小病毒的分离鉴定及其生物学特性研究被引量：3
- 2015年
- 采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,采用胶体金试纸条和PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和PCR检测病毒在F81细胞中的增殖动态,采用无血清培养和有血清培养2种方法进行体外培养,IPMA测定病毒滴度。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,经序列测定后采用DNAStar 7.0和MEGA 5.0软件进行生物信息学分析。结果表明,胶体金试纸条检测为CPV抗原阴性,PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,将分离得到的病毒命名为CPV-NY130615。IPMA可从感染后6 h的F81细胞中检出病毒,PCR能从感染后6 h培养上清中检出CPV核酸。血清同步接种培养法培养和无血清单层接种培养法培养的第15代病毒滴度分别为1×108.06TCID50/m L和1×107.65TCID50/m L。序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1 755 bp,编码584 aa。进化分析显示,该毒株属于CPV-2a型。
- 卜宾李生涛毛倩倩唐青海唐存多焦铸锦姚伦广阚云超
- 关键词：犬细小病毒生物学特性
- The correlation of cyclin A expression level with porcine circovirus type 2 propagation efficiency
- Porcine circovirus type 2 (PCV2) is an important pathogen in swine and it is assumed that PCV2 replication is ...
- 唐青海Shengbin LiHui ZhangYanwu WeiHongli WuJianbo LiuYiping WangDan LiuZhihui ZhangChangming Liu
- 文献传递
- The correlation of cyclin A expression level with porcine circovirus type 2 propagation efficiency
- Porcine circovirus type 2 (PCV2) is an important pathogen in swine and it is assumed that PCV2 replication is ...
- 唐青海Shengbin LiHui ZhangYanwu WeiHongli WuJianbo LiuYiping WangDan LiuZhihui ZhangChangming Liu
- 关键词：PCV2CYCLINACDK2
- 表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性被引量：1
- 2012年
- 为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。
- 张飞雁唐青海黄立平危艳武吴洪丽郭龙军付玉洁刘长明
- 关键词：猪圆环病毒2型口蹄疫病毒VP1蛋白中和表位重组病毒
