云南省教育厅科学研究基金(2010Y398)
- 作品数：16 被引量：27H指数：3
- 相关作者：曾韦锟井申荣洪愉黄芬冯梦蝶更多>>
- 相关机构：昆明理工大学成都军区昆明总医院昆明学院更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究计划面上项目云南省教育厅科学研究基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 乳酸乳球菌表面展示技术被引量：1
- 2013年
- 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是革兰氏阳性益生菌,作为食品安全级微生物,它在当今社会的多个方面得到运用。利用基因工程手段可以将多种外源蛋白质表达并展示在乳酸乳球菌的表面,使蛋白质的生物学功能得以展示,进而应用于工业和农业。又由于乳酸乳球菌不产生脂多糖和其他毒素,所以也能很好地运用于医学等相关研究。
- 冯金曾韦锟井申荣
- 关键词：乳酸乳球菌
- 基于Profinity eXact系统的可溶性egfp表达和纯化被引量：2
- 2014年
- 为研究Profinity eXact系统在蛋白表达及纯化过程中的效果,利用PCR扩增绿色荧光蛋白基因egfp,定向克隆至表达载体pPAL7上,转化BL21(DE3),荧光显微镜下观察诱导后的重组菌;取超声破碎的上清挂柱纯化,紫外下检测纯化后egfp发出荧光的特性,Western blot分析其免疫反应性。结果表明:诱导后的重组菌pPAL7-egfp/BL21(DE3)在紫外光下能够发出绿色荧光;一步纯化后的egfp蛋白同样也能在紫外激发下发出绿色荧光,同时egfp蛋白能和特异性抗体结合,具有良好的免疫反应性。实验结果说明Profinity eXact系统对于可溶性蛋白的表达和纯化,方法操作简单、快捷,具有很好的应用价值。
- 冯金洪愉黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：纯化原核表达
- 甲型副伤寒沙门菌噬菌体的分离及其生物学特性的分析被引量：8
- 2014年
- 目的分离甲型副伤寒沙门菌（副甲菌）噬菌体（副甲噬菌体），并分析其生物学特性。方法从昆明某医院污水中分离副甲噬菌体，并采用噬斑形成法检测其滴度；透射电镜下观察浓缩纯化后的副甲噬菌体形态；分析副甲噬菌体对不同pH（1～12）和不同温度（40、50、60、70、80℃）作用的敏感性；培养副甲菌和副甲噬菌体，以不同培养时间为横坐标，对应的噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，并测定爆发量、最佳MOI及副甲菌突变率；提取副甲噬菌体基因组，酶切分析副甲噬菌体核酸，SDS-PAGE分析副甲噬菌体外壳蛋白；采用热酚法提取脂多糖（1ipopolysac-chafide，LPS），采用苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfnnvl fluoride，PMSF）法提取外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），初步分析副甲噬菌体的受体。结果在医院的污水中分离出的副甲噬菌体，经双层平板计数可见大小不一、透明的噬斑，滴度在109.10mPFU之间，透射电镜观察可见长尾和一个头部；副甲噬菌体在pH值3～10之间滴度较高，40℃以上，随温度上升滴度明显降低，在80℃几乎无活性副甲噬菌体存在；副甲噬菌体感染潜伏期为20min，爆发期为50min，爆发量129，最佳MOI为0.2，副甲菌突变率为5.8×10^-7～2.2×10^-6；副甲噬菌体基因组的单酶切产物均可见33bp的特异条带，SDS-PAGE分析可见4条主带；LPS、OMP能与副甲噬菌体结合，是副甲噬菌体的受体。结论副甲噬菌体为长尾噬菌体，基因组为dsDNA，大小为33bp，最佳MOI为0.2，受体位点为LPS和OMP。
- 毛普加冯金洪愉黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：沙门菌甲型副伤寒细菌噬菌体生物学特性
- 带锚定基序3LysM的EGFP融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示被引量：4
- 2014年
- 目的探索融合有锚定序列的EGFP蛋白,能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法采用融合PCR方法扩增带有锚定序列的egfp(3LysM-egfp),亚克隆至pMD18T载体,测序正确后,插入表达载体pET28a转化BL21(DE3)进行诱导表达、纯化,将纯化的3LysM-EGFP与乳酸乳球菌进行体外混合作用,荧光显微镜及Western-blot检测展示效果。结果成功构建表达重组菌pET28a-3LysM-egfp/BL21并诱导出可溶性3LysM-EGFP,纯化后蛋白纯度达到81.5%,荧光显微镜及Western-blot均检测到展示的目的蛋白。结论纯化后的3LysM-EGFP能在体外条件下展示在乳酸乳球菌表面。
- 冯金洪愉毛普加冯梦蝶许泽仰黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：乳酸乳球菌纯化
- 乳酸乳球菌载体疫苗
- 2012年
- 乳酸乳球菌是一种在食品工业中广泛应用的安全级微生物,应用基因工程手段能使乳酸乳球菌表达多种病毒、细菌、寄生虫的外源蛋白。乳酸乳球菌可经粘膜途径免疫,能有效递呈抗原,诱导外源蛋白的特异性免疫应答,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫,因此可作为潜在的疫苗载体。本文对乳酸乳球菌载体疫苗的优势、应用以及疫苗设计时需要考虑的问题进行了概述。
- 刘艳春曾韦锟井申荣
- 关键词：乳酸乳球菌疫苗抗原粘膜免疫疫苗载体
- 宿主菌抗噬菌体机制的研究进展被引量：4
- 2015年
- 噬菌体又称细菌病毒,是公认最丰富的微生物,也是最多样性的,这种多样性是适应所面对选择性压力例如普遍存在宿主菌的噬菌体抗性机制。噬菌体通过6步(吸附、注入、复制、转录翻译、组装和释放)侵入细菌并使之裂解,但是当噬菌体感染细菌,就会面临细菌抗噬菌体的机制,宿主菌能够进化出多种抗噬菌体的机制来避免噬菌体的侵染和裂解。本文就对宿主菌抗噬菌体各种机制作一综述。
- 毛普加曾韦锟洪愉冯梦蝶许泽仰
- 关键词：宿主菌噬菌体抗性机制
- F_(212-489)-3LysM融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示
- 2015年
- 探索C端融合有锚定序列3Lys M的呼吸道合胞病毒F截短蛋白(F212-489),能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。采用PCR方法扩增f212-489及3lys M基因,分别亚克隆至p MD18-T载体,在亚克隆载体中酶切回收上述两片段,插入p ET28a构成p ET28a-f212-489-3lys M,酶切鉴定并测序正确后转化BL21(DE3),经IPTG诱导获得的包涵体蛋白进行溶解、复性,将复性后的F212-489-3Lys M与乳酸乳球菌MG1363体外混合,通过全菌ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay)检测融合蛋白吸附菌体的情况。成功构建重组菌p ET28-f212-489-3lys M/BL21(DE3),该菌诱导后F212-489-3Lys M主要以包涵体形式表达,F212-489-3Lys M与MG1363混合后,经全菌ELISA检测,F212-489-3Lys M组OD450远高于对照组,且差异非常显著(P<0.01)。证明经大肠杆菌表达的重组蛋白F212-489-3Lys M经体外混合可展示于乳酸乳球菌MG1363表面。
- 许泽仰洪愉冯梦蝶毛普加赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：乳酸乳球菌呼吸道合胞病毒F蛋白
- 乳酸乳球菌组成型表面展示载体的构建及鉴定被引量：1
- 2015年
- 目的探索融合有Usp45信号肽和3Lys M锚定序列的EGFP蛋白能否通过p32启动子组成型展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法融合PCR法分别将p32启动子与Usp45信号肽、3Lys M与egfp基因融合亚克隆至p MD-18T载体,鉴定正确后命名为18T-p Usp45、18T-3Lys M-egfp,分别将上述片段切下依次插入p MG36e构建p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp。将其转化入乳酸乳球菌MG1363,荧光显微镜观察及SDSPAGE、Western-blot检测。结果成功构建重组菌p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp/MG1363,荧光显微镜、SDSPAGE和Western-blot检测表明重组蛋白能在MG1363中组成型表达,且分泌至胞外并锚定在细胞壁上。结论成功地构建了组成型表面展示载体p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp,重组蛋白能分泌至胞外且展示在MG1363细胞壁上。
- 冯梦蝶毛普加洪愉毛小萍许泽仰宋武战杨洪文赵继华黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：乳酸乳球菌组成型表达
- 噬菌体受体及其鉴定方法被引量：2
- 2014年
- 目的噬菌体又称细菌病毒,它可以侵入细菌使细菌裂解。噬菌体受体位于宿主细胞表面,能被噬菌体识别并特异性结合。噬菌体受体多种多样,包括细菌膜蛋白、LPS、磷壁酸,也可以是菌毛、鞭毛、荚膜多糖等。噬菌体在微生态平衡、微生物控制等方面具有重要意义,为了更好地研究噬菌体和挖掘噬菌体潜在价值,确定噬菌体受体是十分关键的一步。本研究就细菌噬菌体受体进行分类介绍,并对噬菌体受体鉴定方法进行总结。
- 毛普加洪愉毛小萍井申荣曾韦锟
- 关键词：噬菌体受体
- 甲型副伤寒杆菌抗噬菌体及生物膜形成基因的筛选及鉴定被引量：2
- 2015年
- 细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)与大部分的细菌感染相关,有助于病原菌抵抗外部不利的环境,包括抗生素和抗噬菌体等.为了研究生物膜和抗噬菌体的作用机制,本文以6株抗噬菌体甲型副伤寒杆菌(副甲菌)突变菌作为研究对象,在Rif+(利福平)(200 mg/L)平板中划线并滴加噬菌体验证能否抗噬菌体,将6株突变菌接种于96孔板中,每组3个重复,观察其成膜能力以及生物膜的形态,定点突变和互补实验验证突变菌的噬菌体抗性是否由突变基因所引起.结果显示:划线平板中野生型副甲菌在滴加1.2×106个噬菌体处出现空缺,而6株突变菌在滴加2.4×109个噬菌体后仍能生长,表明6株突变菌具有抗噬菌体特性;6株突变菌中,σ-54依赖的翻译调节器突变菌成膜能力(A595=1.1±0.2)较野生型副甲菌(A595=0.5±0.1)显著性增强,且差异显著(P<0.05),光学显微镜下菌体聚集成粗大的不规则团块;同源重组敲除野生型副甲菌σ-54依赖的翻译调节器,突变菌出现噬菌体抗性,将表达σ-54依赖的翻译调节器的载体转化该突变菌,突变菌又恢复了噬菌体敏感性.结果表明,σ-54依赖的翻译调节器是抗噬菌体和生物膜形成相关的基因.
- 毛普加冯梦蝶洪愉许泽仰赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：甲型副伤寒沙门菌转座生物膜
