国家自然科学基金(30500204)
- 作品数：5 被引量：11H指数：3
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- 相关机构：西安交通大学医学院第二附属医院西安交通大学更多>>
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- In-fusion技术构建表达、纯化钠泵α3亚单位膜外区截断性片段重组质粒被引量：4
- 2009年
- 目的构建重组pGEX-6P-1原核表达载体，表达和纯化大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区的截断性片段。方法利用In-fusion技术将钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区基因片段插入线性化的pGEX-6P-1载体中，转化，提取质粒，PCR鉴定；用阳性重组质粒pGEX-Trf-α3转化大肠杆菌，IPTG诱导、表达融合蛋白GST—Trf-α3。采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性及含量。采用放射性配体结合法检测其生物活性。结果PCR和基因测序分析显示大鼠钠泵a3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区被成功插入pGEX-6P-1载体GST基因3’端，蛋白序列分析表明GsT-Trf-α3融合蛋白总长度262个氨基酸，理论相对分子质量应约为33．22×10^3。IPTG诱导后，GST-Trf-α3融合蛋白的表达量为10％，多以可溶性形式存在，可溶性蛋白表达量为80．8％。SDS-PAGE结果显示其纯度〉95％。生物活性实验结果显示GST—Trf-α3融合蛋白与^3H-哇巴因具有一定的结合能力，但结合能力较弱。结论采用In-fusion技术成功构建了表达GST-Trf-α3融合蛋白的原核表达载体，建立了纯化方法，获得高纯度的融合蛋白，为钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区功能以及其潜在的药理学作用研究获得了实验数据。
- 张明娟杨军朱参战段宗明牛小麟王蓉宋雅燔
- 哇巴因抑制纤维连结蛋白在大鼠血管平滑肌细胞中的表达
- 2015年
- 目的研究哇巴因对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中纤维连结蛋白(fibronectin,FN)表达的影响,探讨钠泵α亚单位离子转运活性在ECM形成中的作用。方法采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉VSMCs原代培养,并运用免疫组织化学方法进行细胞鉴定并检测FN在VSMCs中的表达。结果随着培养液内哇巴因浓度的增加,VSMCs中FN的表达逐渐下调,而且半定量结果分析显示,不同剂量哇巴因干预组间VSMCs中FN的表达存在统计学差异。结论哇巴因可能通过抑制VSMCs钠泵活性而下调FN的表达,为高血压的研究提供新的实验依据。
- 张明娟杨军张美程张超英朱参战段宗明
- 关键词：哇巴因纤维连接蛋白血管平滑肌细胞钠泵
- 人Na^+、K^+-ATPase α1亚单位M1～M2膜外区片段结合活性的研究被引量：4
- 2009年
- 目的研究包含人Na+、K+-ATPaseα1亚单位M1～M2膜外区的多肽片断(HES1衍生物),是否具有与哇巴因结合的能力。方法采用Fmoc固相合成法进行多肽合成,产物经HPLC纯化,并进行质谱分析。然后采用放射性配体受体结合法检测其与哇巴因的结合能力。结果人Na+、K+-ATPaseHES1衍生物与3H-哇巴因具有一定的结合能力。3H-ouabain与Na+,K+-ATPaseHES1衍生物结合的平衡解离常数为24.58nmol·L-1,受体密度为492.43fmol·mg-1蛋白。IC50=3.078×10-7mol·L-1。结论人Na+、K+-ATPaseHES1衍生物具有与哇巴因结合的活性,为其作为一种新型药物奠定实验基础。
- 张明娟杨军朱参战段宗明牛小麟王蓉
- 关键词：膜外区哇巴因
- 抗钠泵α2亚单位截断性片段多肽抗体的制备与鉴定被引量：1
- 2015年
- 目的采用多肽制备技术和免疫学技术制备抗钠泵α2亚单位截断性片段及其抗体,为检测和研究钠泵α2亚单位的组织学分布及其功能研究提供实验基础。方法根据NCBI-Genebank获得大鼠钠泵α2亚单位M1~M2膜外区截断性片段目的多肽（LAAMEDEPSNDN）,采用9-氟甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成目的多肽,并采用碳化二亚胺法制备出多肽与孔戚血蓝素复合物,免疫新西兰大白兔,免疫4次后获得抗血清,测定其效价。随后采用protein A纯化Ig G抗体,并将其用于大鼠主动脉血管平滑肌细胞钠泵α2亚单的组织学检测。结果（1）人工合成的大鼠钠泵α2亚单位截断性片段长13氨基酸残基（LAAMEDEPSNDN-C）,理论相对分子质量：1408.48,质谱实测相对分子质量：1407.90;高效色谱分析纯度HPLC纯度〉85.5%;（2）ELISA法检测免疫后兔子的抗血清效价均大于1∶512 000,蛋白A亲和纯化获得亲和纯化抗体浓度为0.965 mg/ml,按照1∶1000稀释（终浓度1μg/ml）,ELISA检测抗体效价为1∶256 000;（3）该抗体按照1∶100~1∶200稀释可用于免疫细胞学检测。结论成功制备高效价抗钠泵α2亚单位截断性片段抗体可用于钠泵α2亚单位的ELISA和免疫细胞化学实验,为钠泵α2亚单位的组织细胞学检测和功能研究提供新的实验基础。
- 张明娟张美程朱参战张超英段宗明
- 关键词：钠泵多肽抗体
- 大鼠钠泵α2亚单位M1-M2膜外区多肽体外活性鉴定被引量：3
- 2008年
- 本文旨在研究含大鼠钠泵α2亚单位M1-M2膜外区的多肽片段（peptide containing rat sodium pumpα2subunit M1-M2extramembrane fragment,RES2衍生物）是否具有与内源性钠泵抑制因子结合以及改善钠泵α亚单位活性的作用。采用Fmoc固相合成法合成多肽（Leu-Ala-Ala-Met-Glu-Asp-Glu-Pro-Ser-Asn-Asp-Asn-Gly-Gly-Gly-Ser）,产物经高效液相色谱技术纯化,并进行质谱分析。采用放射性配体-受体结合法检测其与哇巴因的结合能力,进而采用人红细胞86Rb摄取实验检测其生物学活性。结果显示,RES2衍生物与3H-哇巴因具有一定的结合能力,其平衡解离常数（Kd）为38.46nmol/L,IC50为6.353nmol/L。RES2衍生物可以阻断哇巴因对红细胞膜Na＋,K＋-ATPase的抑制作用,使红细胞86Rb摄取率从38.53%上升到83.69%左右,并呈一定的剂量依赖关系。因此,RES2衍生物不仅具有体外结合活性,而且具有改善钠泵活性的生物学效应,为其成为有效的抗高血压药物提供科学依据。
- 张明娟杨军强磊王蓉宋亚燔牛小麟
- 关键词：膜外区哇巴因高血压
