国家自然科学基金(30771917)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
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- CheA／CheY二元信号系统调控空肠弯曲菌体外趋化和体内定植的研究被引量：1
- 2011年
- 目的 探讨空肠弯曲菌CheA和CheY调控细菌体外趋化和体内定植中的作用及其机制.方法 分别以pET42a和E.coli BL21DE3为表达载体和表达宿主菌,构建空肠弯曲菌NCTC11168株cheA和cheY基因原核表达系统.制备重组表达的rCheA和rCheY兔抗血清并用DEAE-52离子交换法提取其IgG.采用pBiuescript-Ⅱ-SK构建自杀质粒,制备cheA基因敲除的cheA-突变株.采用基于脱氧胆酸钠硬琼脂法（DOC-HAP）的空肠弯曲菌体外趋化模型,检测cheA-突变株趋化能力的变化,同时分别观察rCheA-IgG和氯氰碘柳胺钠对细菌趋化的抑制作用.采用rCheA-IgG和CheY-IgG捕获法,测定DOC作用后空肠弯曲菌CheA和CheY磷酸化水平变化.采用小鼠感染模型比较cheA-突变株和野生株定植能力的差异.结果 所构建的原核表达系统能有效表达rCheA和rCheY.PCR和测序结果证实eheA-突变株染色体DNA中cheA基因被敲除.cheA-突变株丧失对DOC的趋化能力,rCheA-IgG和氯氰碘柳胺钠均对空肠弯曲菌野生株趋化有明显的抑制作用（P〈0.05）.在DOC作用下,空肠弯曲菌野生株CheA和CheY磷酸化水平迅速下降（P〈0.05）.cheA-突变株定植小鼠空肠的能力也明显不如野生株（P〈0.05）.结论 CheA/CheY组成了空肠弯曲菌趋化相关二元信号传导系统（Che-TCSS）,两者均去磷酸化被激活.Che-TCSS中CheA在空肠弯曲菌体外趋化和体内定植中发挥了关键作用,可作为研发抗空肠弯曲菌感染新药的靶标.
- 王媛楼宏强王欢胡玮琳严杰
- 关键词：空肠弯曲菌趋化定植
- 空肠弯曲菌fliG基因敲除突变株动力、体外趋化和小鼠定植能力的改变
- 2009年
- 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是人类细菌性胃肠炎的病原体。趋化是细菌向合适的寄生部位定向运动,也是空肠弯曲菌在宿主空肠黏膜表面实现定植的关键起始步骤,该趋化运动由趋化相关二元信号系统(che-TCS)以MCPs→Ches→Flis/Mots方式调控。FliG是Fli蛋白家族成员,一些病原菌的FliG被证明是鞭毛马达蛋白,也是细菌鞭毛马达中开关复合体的必需组分,但空肠弯曲菌FliG在细菌趋化中的作用未明。本研究中,我们根据同源重组原理,构建空肠弯曲菌NCTC11168株fliG基因敲除(fliG-)突变株,然后对fliG-突变株的动力、趋化和定植能力进行测定。动力实验和体外趋化实验结果证实,fliG-突变株在半固体琼脂平板上的菌落直径、在硬琼脂平板上对0.2mol/L脱氧胆酸钠(SDC)的趋化聚集环直径均明显小于野生株(P<0.05)。与野生株比较,黏附于BALB/c-ByJ小鼠空肠黏膜表面以及空肠内容物中的fliG-突变株数量也明显减少(P<0.05)。实验结果表明,fliG是空肠弯曲菌鞭毛动力以及细菌感染时向空肠黏膜趋化运动的必需基因。
- 全胜夏肖萍赵欣罗依惠严杰
- 关键词：空肠弯曲菌基因敲除趋化定植
- 空肠弯曲菌mcp1／2／3基因原核表达及其产物与细菌趋化作用的相关性被引量：4
- 2009年
- 目的克隆空肠弯曲菌（Campy1obacter jejuni）接受甲基趋化蛋白（MCP）编码基因mcp1、mcp2和mcp3并构建其原核表达系统，建立空肠弯曲菌体外趋化模型并确定趋化诱导物质，了解MCPs与趋化诱导物之间的关系。方法PCR扩增mcp1、mcp2和mcp3基因片段，T-A克隆后测序。构建上述目的基因原核表达系统，SDS—PAGE和Bio-Rad凝胶成像分析系统检查目的重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况，Ni—NTA亲和层析法提纯rMCPs。rMCPs免疫家兔获得抗血清，免疫扩散法测其效价。用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG，经胃蛋白酶酶解和Sephadex G-100层析制备IgG F（ab′）2。建立HAP（hard—agar plus）法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用。采用基于IgG F（ab′）2封闭的趋化阻断试验，确定不同MCPs的功能及其差异。结果PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mcp3基因片段，其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPs，其产量均约为细菌总蛋白的10％。rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体，其免疫扩散效价均为1：4。牛胆汁和脱氧胆酸钠（DOC）对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用（P〈0．05）。MCP1和MCP2被其IgG F（ab′）2封闭后，空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱（P〈0．05），MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响（P〉0．05）。结论本研究成功地表达了空肠弯曲菌MCPs蛋白。牛胆汁和DOC是诱导空肠弯曲菌趋化的信号物质，MCP1和MCP2可能参与该菌对DOC的趋化过程。
- 李志锋赵金方楼宏强毛亚飞李立伟林旭瑷严杰
- 关键词：空肠弯曲菌趋化
- motA基因在空肠弯曲菌致病性相关趋化和定植中的作用被引量：2
- 2010年
- 目的确定鞭毛马达蛋白（flagellarmotorprotein）MotA编码基因在空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）致病性相关趋化和定植中的作用。方法采用PCR扩增motA基因以及用于motA基因敲除的Kan。基因和plus—motA基因片段，目的扩增产物克隆后测序。根据同源重组原理，构建空肠弯曲菌NCTClll68株motA基因自杀质粒（pBlueskrit-Ⅱ-SKmotA-kan）和motA基因敲除突变株（motA-）。采用半固体平板迁移试验、基于硬琼脂平板（hardagarplus，HAP）的脱氧胆酸钠（SDC）体外趋化试验、小鼠空肠定植试验，了解空肠弯曲菌motA-突变株和野生株鞭毛动力、SDC趋化和BALB／c-ByJ小鼠空肠内定植能力差异性。结果所克隆的空肠弯曲菌motA基因核苷酸和氨基酸序列与已报道的相应序列相似性为100％。PCR和测序及含抗生素培养基连续传代培养结果证实，自杀质粒和motA-突变株构建成功。motA-突变株在半固体琼脂平板上的菌斑直径、在HAP上对0．2mol／LSDC趋化聚集环直径、黏附于小鼠空肠黏膜表面以及空肠内容物中motA-突变株数量均明显少于野生株（P〈0．05）。结论本研究成功构建了空肠弯曲菌motA基因敲除突变株。motA基因是空肠弯曲菌鞭毛动力以及致病性相关趋化和定植的必需基因。
- 阮萍孙爱华赵欣严杰
- 关键词：空肠弯曲菌趋化定植
