国家重点基础研究发展计划(2009CB521702)
- 作品数：8 被引量：23H指数：4
- 相关作者：王波周虹刘庆军魏旭冉尹玉静更多>>
- 相关机构：军事医学科学院哈尔滨医科大学附属第二医院哈尔滨医科大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划北京市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 血红素加氧酶-1显性负性突变体转基因小鼠模型的建立与鉴定
- 2010年
- 目的建立血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)显性负性突变体G143H转基因小鼠模型。方法通过SalI/DraI酶切pCAGGHO-1G143H转基因表达载体,纯化回收HO-1G143H表达盒片段;通过显微注射把表达目的基因的DNA片段导入FVB小鼠受精卵原核,并移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠;用PCR对子代鼠尾DNA进行鉴定,并用Southern blot对结果做进一步验证;通过RT-PCR、免疫组化和Western blot方法检测HO-1基因的表达。结果表达盒回收片段正确;假孕鼠出生的17只子代小鼠共有3只阳性,均为雄性;RT-PCR、免疫组化和Western blot结果表明,阳性小鼠体内的HO-1 mRNA与蛋白表达水平增高。结论成功建立HO-1显性负性突变体G143H表达的转基因小鼠,该模型为研究HO-1在体内的作用机制奠定了基础。
- 王波程萱刘庆军魏旭冉尹玉静高旭杨晓周虹
- 关键词：HO-1显微注射法转基因小鼠
- 血红素加氧酶-1重组载体的构建及在胃癌细胞中的初步研究
- 2010年
- 目的构建人血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）及其突变体的真核表达载体，观察其在胃腺癌细胞中HO-1表达和活性变化，研究HO-1活性变化的胃腺癌细胞对顺铂抗药能力的变化，为进一步研究HO-1对肿瘤细胞影响机制奠定基础。方法根据GenBank中HO-1cDNA序列设计引物，调取基因并克隆入pcDNA3．1（＋）质粒中，构建表达人野生型HO-1与突变型HO-1（HO-1G143H）的重组质粒。脂质体介导重组质粒转染胃腺癌细胞BGC823，用RT—PCR和Western印迹法分别检测细胞中HO-1mRNA的表达和蛋白表达水平，体外测定HO—1活性变化，应用顺铂进行体外抗药性实验。结果酶切鉴定和测序证实，HO-1真核表达载体构建成功；转染质粒后的BGC823，HO-1的mRNA和蛋白的表达水平明显上升；转入野生型质粒的细胞HO-1活性上升，转入突变型质粒的细胞HO-1活性下降；HO-1活性下降BGC823细胞抗顺铂杀伤能力增强。结论构建了HO-1野生型与突变型真核表达载体；将其转入胃腺癌细胞，引起了HO-1的mRNA和蛋白表达的增加和活性变化；体外实验表明，HO-1活性下降的BGC823细胞抗顺铂能力增强。
- 王波刘庆军于景翠尹玉静魏旭冉周虹
- 关键词：血红素加氧酶-1肿瘤基因重组
- MMP-2-PEX原核表达纯化及其对黑色素瘤细胞与内皮细胞黏附的影响
- 2010年
- 目的探讨原核表达的人源基质金属蛋白酶2的C端结构域(MMP-2-PEX)对黑色素瘤细胞A375与内皮细胞黏附的影响。方法利用RT-PCR方法从人成纤维肉瘤细胞HT1080中克隆MMP-2 C端结构域,构建原核表达载体pET-His-PEX;转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;盐酸胍裂解包涵体,经镍琼脂糖凝胶柱纯化,透析复性后获得MMP-2-PEX蛋白,随后对其进行Western印迹和质谱鉴定。采用明胶酶谱法检测MMP-2-PEX的活性;采用平行板流动小室系统检测在流动状态下MMP-2-PEX对A375细胞与脐静脉内皮细胞HUVEC黏附的影响,通过小鼠实验性肺转移模型检测MMP-2-PEX对A375细胞在小鼠肺内癌栓形成的影响。结果 Western印迹和质谱鉴定原核表达的MMP-2-PEX蛋白正确,明胶酶谱检测MMP-2-PEX能够明显抑制MMP-2的活性。表达的MMP-2-PEX蛋白能够在流动状态下抑制A375细胞与HUVEC细胞的黏附,其黏附抑制率与MMP-2-PEX蛋白浓度增加成正相关,MMP-2-PEX浓度为12.5,25和50μg/ml时抑制率分别为32.5%,41.4%和53.9%。用MMP-2-PEX处理后,A375细胞在小鼠肺内癌栓的形成与对照组相比降低了26.4%。结论原核表达的人MMP-2-PEX在体外流动状态下可抑制A375细胞与内皮细胞的黏附,并抑制A375细胞在小鼠肺内癌栓的形成。
- 宋直钰赵敬湘魏广智张磊汤永永王字玲
- 关键词：基质金属蛋白酶2黑色素瘤细胞黏附内皮细胞
- 肿瘤相关蛋白spindlin 1的表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)
- 2014年
- 目的制备spindlin 1蛋白的多克隆抗体,为spindlin 1的功能研究和肿瘤筛查奠定基础。方法 spindlin 1-谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(spindlin 1-GST)在大肠杆菌中表达,切除GST后,将纯化的spindlin 1蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。Hitrap Protein A柱纯化spindlin 1抗血清,ELISA测定抗体效价。用Western蛋白质印迹法和免疫组化方法检测抗体的特异性。结果 ELISA检测结果表明,纯化的spindlin 1多克隆抗体效价为1∶2000。Western蛋白质印迹法实验结果表明,纯化的spindlin 1多克隆抗体能够与转染pAdeasy-myc-spindlin 1载体的HeLa细胞抽提物中spindlin 1蛋白结合,与Myc抗体检测位置一致。免疫组化结果表明,转染增强型绿色荧蛋白(EGFP)和spindlin 1(pEGFP-C3-spindlin 1)的HeLa细胞发绿色荧光,其细胞核中有spindlin 1蛋白表达。且spindlin 1多克隆抗体能够特异性识别卵巢癌组织中的spindlin 1蛋白。结论成功制备肿瘤相关蛋白spindlin 1的多克隆抗体,能够特异性检测细胞和组织中spindlin 1蛋白表达。
- 陈琳曾泉张鹏王静雪秦立篷吕洋南雪岳文裴雪涛
- 关键词：多克隆抗体卵巢肿瘤
