国家自然科学基金(81273437)
- 作品数：10 被引量：21H指数：2
- 相关作者：金坚陈蕴钱凯雷楗勇高昊更多>>
- 相关机构：江南大学温州大学苏州大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 人血清白蛋白-血管钠肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2014年
- 人工合成VNP基因,通过酶连构建HSA和VNP基因的融合基因,插入表达载体pPIC9K,电转至毕赤酵母GS115,构建成工程茵,甲醇诱导表达。重组表达质粒经双酶切验证构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析分子量为69 000 Da,与理论值相符;Western blot鉴定产物兼有HSA和VNP免疫原性,说明其为杂合分子;兔胸主动脉环离体灌流实验证明融合蛋白具有舒张血管活性。本研究说明毕赤酵母适于HSA-VNP融合蛋白的表达,为进一步开发稳定的VNP药物提供了生物制备方法。
- 崔燕生姜曰水高昊雷楗勇钱凯陈蕴段作营金坚
- 关键词：毕赤酵母
- 人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达被引量：5
- 2016年
- 干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。
- 李成媛张晶晶钱凯缪亚娜蔡燕飞杨剑峰何杨金坚
- 关键词：人血清白蛋白干扰素Α2B中国仓鼠卵巢细胞
- BNP在不同缓冲体系中的血管舒张功能评价被引量：1
- 2013年
- 为了明确能使人脑纳肽（Brain Natriuretic Peptide）保持活性的适用缓冲溶液条件,采用常规离体血管灌流实验,观察人脑纳肽的不同缓冲溶液对家兔离体兔胸主动脉血管片段舒张功能的影响.研究发现,在以柠檬酸/磷酸氢二钠为基质的缓冲液条件下,BNP在10-8～10-5 mol/L浓度区间对家兔血管舒张均呈良好的剂量依赖关系,而以醋酸/醋酸钠或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾为基质的这两种缓冲液虽有一定的舒张效果,但没有剂量依赖关系.由此表明,在合适的pH条件下（4或5）,柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液具有作为改进BNP注射剂处方的潜在价值.
- 高昊刘利平马鑫陈蕴金坚
- 甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达
- 2016年
- 人甲状旁腺激素是由人甲状腺旁腺主细胞分泌合成的一种单链多肽激素,成熟的甲状旁腺激素含84个氨基酸残基,其活性区域为N-末端1-34氨基酸片段,目前已上市的PTH药物也以34个氨基酸残基的多肽为主,主要用于治疗老年骨质疏松以及绝经后妇女骨质疏松。但是PTH的稳定性较差,导致体内半衰期短,难以形成有治疗作用的稳态血药浓度,从而限制了其临床应用。因此,设计稳定并能保持原有生物活性的PTH药物分子至关重要。构建含有融合蛋白基因PTH-HSA的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的NEO基因进行筛选,最终得到能稳定表达目的蛋白的重组细胞,并在5L发酵罐中进行表达,融合蛋白PTH-HSA表达量达到155mg/L。Western blot检测显示,该融合蛋白同时具有HSA和PTH双重免疫原性。
- 张焕徐栋生蔡燕飞陈蕴金坚
- 关键词：融合蛋白中国仓鼠卵巢细胞
- 表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大被引量：2
- 2016年
- 毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2∶M4=1∶1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9-7.4,DO为40%-60%,细胞密度达到7.0×106cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。
- 蔡燕飞李成媛张晶晶缪亚娜刘克东熊文典陈蕴金坚
- 关键词：干扰素Α2B白蛋白CHO细胞
- 细胞穿膜肽TAT与小鼠干细胞转录因子Oct4融合表达及纯化被引量：2
- 2013年
- 将TAT-Oct4目的基因插入pET28a表达载体,构建重组表达质粒pET28a-TAT-Oct4,形成大肠杆菌重组表达体系。融合蛋白TAT-Oct4在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达产物经纯化后,纯度可达90%以上。通过尿素梯度透析复性,TAT-Oct4平均复性收率为8.8%。细胞免疫荧光技术分析表明,TAT-Oct4融合蛋白可穿透近100%细胞的细胞膜,其进膜后主要分布于细胞核内。建立了具有活性的TAT-Oct4融合蛋白生物制备方法,为细胞重编程提供了一种有效的研究材料,并可为其他用于细胞重编程的干细胞转录因子设计提供实用的方法学。
- 王军雷楗勇陈蕴金坚
- 关键词：包涵体纯化
- 稳定表达GLP-1类似物的CHO细胞株的构建及培养工艺研究被引量：2
- 2017年
- 胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)是一种治疗II型糖尿病的潜在药物,针对其在体内半衰期短和在酵母中表达的批次间不稳定等问题,课题组前期对其进行改造,成功利用p MH3载体在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合蛋白NGGH[6×His-tag+Ek+2×GLP-1(A2G)+HSA]。现利用新型载体pcDNA3.1,构建含融合蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/NGGH,经电击转染转入CHO细胞中。G418抗性压力筛选后利用一种新型的细胞成像系统高效快速地筛选出高表达单克隆株。表达的目的蛋白经WB(Western blot)验证显示,产物具有GLP-1和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高表达细胞株,产量为58mg/L。利用5L AP20激流式生物反应器扩大培养重组细胞,对p H和溶氧控制条件进行了优化。结果显示,在p H6.8~7.4,溶氧(dissolved oxygen,DO)两相控制的条件下,蛋白质最终表达量可达148mg/L。
- 张晶晶刘克东钱凯缪亚娜蔡燕飞李成媛陈蕴金坚
- 关键词：胰高血糖素样肽-1中国仓鼠卵巢细胞
- 钠尿肽受体的结构特征及信号转导机制被引量：2
- 2013年
- 钠尿肽是一组由心肌细胞等分泌的激素,主要包括ANP,BNP和CNP等,它们可通过自分泌或旁分泌作用于邻近的心肌细胞、血管平滑肌细胞等,与靶细胞膜上特异的钠尿肽受体NPR-A,NPR-B和NPR-C结合,启动一系列细胞内信号转导,发挥其利尿、利钠、舒张血管、降低血压和调节电解质平衡等生理功能.目前,钠尿肽药物已成为急性失代偿性心力衰竭阶段治疗药物研发的热点,因此,研究钠尿肽受体的结构、活性、信号通路及调控,探析钠尿肽受体与钠尿肽功效之间的联系具有重要的理论意义和应用价值.
- 姜曰水陈蕴金坚
- 关键词：鸟苷酸环化酶环磷酸鸟苷信号通路活性调节
- 毕赤酵母系统来源的重组人血清白蛋白的制备及初步晶体学分析被引量：4
- 2015年
- 人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),为血浆中含量最丰富的蛋白质,具有调控血液中的功能蛋白质、脂肪酸、激素、药物和维持血液渗透压功能。毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GSll5/p PIC9K-rHSA经50L发酵罐发酵,发酵液冷冻离心,上清液超滤浓缩后,依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和SP Sepharose 6FF离子层析纯化,实现rHSA的规模化制备,最终rHSA的纯度可达99.9%以上。通过rHSA的结晶条件筛选实验,筛选出沉淀剂分别为PEG 1500、PEG 3350、PEG 6000、MPEG 2000和MPEG 5000五种结晶条件,结晶环境均为疏水性环境,并且结晶环境不能含有类似DTT的强还原剂。其中沉淀剂为MPEG2000条件下优化出的rHSA和pHSA蛋白晶体经X光衍射分辨率最好,分别为3.4魡和3.1魡,通过分子置换法得到rHSA和pHSA的晶体结构,二者结构大体相似,为rHSA在临床上的应用和HSA融合蛋白的晶体结构研究提供可靠的依据和基础。
- 陈蕴黄鹏飞郭瑞庭金坚
- 关键词：人血清白蛋白纯化晶体结构融合蛋白
- 驱动器的规格与吸入辅助装置对气雾剂体外沉积性质的影响被引量：2
- 2017年
- 目的考察驱动器的规格——孔径、孔长以及吸入辅助装置的使用对气雾剂体外沉积性质的影响。方法以自制丙酸氟替卡松混悬型气雾剂为模型药物,装配不同规格的驱动器,使用Andersen多级撞击器(Andersen cascade impactor,ACI)测定体外沉积率;将丙酸氟替卡松气雾剂装配筛选好的特定规格的驱动器,分别在不使用吸入辅助装置与使用吸入辅助装置的情况下,对体外沉积性质进行对比研究。结果在孔径固定的情况下,随着孔长的延长,驱动器的残留量降低,Andersen多级撞击器装置的L型连接管沉积量增加,微细粒子剂量降低。在孔长固定的情况下,随着孔径的增加,驱动器的残留量降低,Andersen多级撞击器装置的L型连接管沉积量增加,微细粒子剂量降低。根据试验结果、混悬型气雾剂本身的剂型特点以及驱动器的实际使用情况,最终,将0.42 mm孔径、0.70 mm孔长的驱动器作为优选驱动器;在使用吸入辅助装置的情况下,Andersen多级撞击器装置L型连接管的沉积量极大地降低,微细粒子剂量增加,原来沉积在L型连接管的大粒子很大一部分被截留在吸入辅助装置当中。结论驱动器的规格会对吸入气雾剂的体外沉积产生一定的影响,在药品研发的过程中,可根据气雾剂产品的具体特点(溶液型或混悬型,原料药的粒径大小等)进行驱动器的筛选;吸入辅助装置的使用可以提高气雾剂的药物利用率,推荐患者用药时使用。
- 陈保垒朱俊卢嘉彤金坚
- 关键词：吸入气雾剂驱动器
