甘肃省自然科学基金(3ZS061-A25-099)
- 作品数：14 被引量：49H指数：4
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- 携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究被引量：15
- 2010年
- 目的构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的转染情况,为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。方法采用DNA重组技术,将insulin基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-EGFP中,筛选阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP共同转染到293T细胞内包装病毒,荧光倒置相差显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况。收集病毒上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度。取足月儿脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs,以不同感染复数(multiple of infection,MOI,分别为0、1、3、5、7、10、15、20)的重组慢病毒感染hUCMSCs,通过报告基因绿色荧光蛋白的表达筛选最适MOI;以最适MOI重组慢病毒感染hUCMSCs,应用实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测细胞中insulin基因及insulin蛋白水平的表达情况。结果成功构建了共表达insulin基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并对其成功包装、纯化及浓缩,病毒滴度为1.3×108TU/mL。不同MOI的重组慢病毒感染hUCMSCs后,通过绿色荧光蛋白表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为10,此时对细胞的转染效率可达到90%。实时荧光定量PCR检测示转染组insulin mRNA表达阳性,未转染组为阴性;Western blot检测示转染组细胞内及上清液insulin蛋白表达阳性,未转染组均为阴性。结论构建的携带insulin基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP可有效转染hUCMSCs,表达insulin蛋白。
- 刘毅薛美思
- 关键词：组织工程脂肪人脐带间充质干细胞胰岛素绿色荧光蛋白基因转染慢病毒表达载体
- 人脂肪间充质干细胞冻存方法的改进被引量：4
- 2007年
- 目的:探索理想的冷冻人脂肪间充质干细胞的方法。方法:采用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞,消化细胞并洗涤离心加入10%二甲基亚砜、30%胎牛血清、60%MEM的细胞冻存体系,直接置-70℃冰箱贮存。冻存4、8和12周后,37℃水浴复温,通过检测细胞周期﹑细胞表型和成脂的多向分化潜能,以鉴定该方法的可行性。结果:消化后不经过传统的程序性降温冻存技术,直接在-70℃冰箱贮存,其细胞生物学特性无明显改变,细胞仍存在成脂的多向分化潜能。结论:人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生物学特性,是冷冻保存的一种可行方法。
- 李春明刘毅
- 关键词：分化脂肪细胞
- 以PLGA为支架的组织工程脂肪的实验研究被引量：12
- 2007年
- 目的:研究以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料的可行性。方法:实验组:取兔的脂肪间充质干细胞,行体外扩增培养至第3代,达到一定数量后成脂诱导1周,接种于PLGA支架上,继续诱导1周,置于兔背部肩胛骨两侧皮下,分别于4、8周从大体和组织学方面观察脂肪形成情况;对照组:单纯以未接种细胞的支架移植于兔背部肩胛骨两侧皮下,于相同时间点进行检测。结果:实验组植入4周后,该复合物在支架中有脂肪形成,并可见细胞突入支架材料中;8周后支架材料继续降解,脂肪组织形成明显,伴有少量血管长入。对照组支架材料逐渐崩解,未见脂肪组织形成。结论:以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料提供了一个好的思路。
- 李春明刘毅陈克明白孟海
- 关键词：脂肪PLGA填充物
- 肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响被引量：3
- 2008年
- 背景:在脂肪组织工程的研究中,若将种子细胞与支架材料复合后移植,则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生。目的:观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响。设计、时间及地点:随机区组设计的动物实验,于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成。材料:纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞-支架复合物。方法:①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞,诱导成脂,携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞生长因子基因的重组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞,流式细胞仪测定转染效率,应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达,将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架。②将75只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为3组:脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿色荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间。主要观察指标:移植后3,7,14,28,60d,每组各取5只大鼠麻醉后处死,取出移植物。电镜观察;并行苏木精-伊红、油红O、Masson’s染色,观察病理改变;同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生长因子表达,观察并计数血管生成。结果:①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴,重组腺病毒感染复数=100时,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64.39%。②移植3,7,14d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组(P<0.05),且3d达到高峰。③移植3,7,14,28,60d时,Ad-肝细胞生长因子�
- 刘婕婷刘毅哈小琴
- 关键词：组织工程脂肪骨髓细胞肝细胞生长因子基因疗法
- 脂肪组织工程研究进展被引量：1
- 2011年
- 成功构建组织工程化脂肪的关键在于：①种子细胞的选定和获取;②具有良好生物降解性和组织相容性的三维支架材料;③种子细胞增殖和分化的微环境。本文就这三方面的研究进展综述如下：
- 李世龙刘毅
- 关键词：脂肪组织工程三维支架材料种子细胞组织工程化组织相容性生物降解性
- 重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞
- 2008年
- 背景：肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成，已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗。目的：鉴于重组腺病毒的宿主范围广，探讨重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、目的蛋白表达及细胞活性的影响。设计、时间及地点；2006—08／2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验。材料：清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞。携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠。方法：向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导。以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞。重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞。主要观察指标：油红。染色检测成脂情况。流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达，计算转染效率。ELISA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达，MTT法检测转染脂肪细胞的活性。结果：①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴，成脂率（97-31±0．46）％。②以100pfu／cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72h后，绿色荧光蛋白表达量达高峰，此时转染效率为65．39％。③以100pfu／cell作为最佳感染强度转染脂肪细胞72h后，肝细胞生长因子的表达量为峰值。与未转染空白对照比较，转染后24，48，72，96，168h脂肪细胞活性均无明显变化（t=-0．024～0．092，P〉0．05）。结论：重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞，有效表达目的蛋白�
- 刘婕婷刘毅哈小琴王有虎蔡黔
- 关键词：骨髓间充质干细胞脂肪细胞重组腺病毒肝细胞生长因子转染
- 影响前脂肪细胞增殖与分化的若干因素被引量：4
- 2007年
- 在脂肪组织工程中，前脂肪细胞是被公认的种子细胞，它是一类具有增殖分化能力的特异化前体细胞，其作用持续于人的一生，与脂肪移植成活率有密切关系。脂肪细胞的增殖分化能力对体外构建脂肪组织起着非常重要的作用，获取足够多的组织并使获得的细胞有较强的增殖能力，是众多研究者期待解决的问题。本文拟就影响脂肪细胞增殖分化的若干因素结合文献综述如下。
- 樊芙蓉刘毅
- 关键词：细胞增殖分化前脂肪细胞分化能力种子细胞前体细胞脂肪移植
- 转染肝细胞生长因子基因对移植颗粒脂肪新生血管形成的影响被引量：1
- 2008年
- 脂肪移植要取得进展，就要深入研究移植后的再血管化。我们以腺病毒为载体，把肝细胞生长因子（HGF）基因导入大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），然后与颗粒脂肪混合移植，充分发挥MSCs多项分化潜能和HGF强大的血管效应，旨在为颗粒脂肪移植建立新生血管诱导生物组织工程模式。
- 王有虎刘毅哈小琴刘婕婷
- 关键词：颗粒脂肪移植肝细胞生长因子新生血管形成生长因子基因再血管化基因导入
- 人脐带间充质干细胞与蚕丝素多孔支架的体外复合培养被引量：11
- 2010年
- 目的观察蚕丝素多孔支架对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）吸附作用及支架对hUCMSCs形态、功能及活性的影响，为脂肪组织工程支架选择提供实验依据。方法将hUCMSCs制成细胞悬液接种在蚕丝素多孔支架，荧光倒置相差显微镜、扫描电镜和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察hUCMSCs的吸附和生长情况。结果培养1～2d后可见hUCMSCs与蚕丝素多孔支架充分附着。培养5～7d细胞生长增殖十分活跃，10d左右时，蚕丝素多孔支架孔中hUCMSCs成片状融合。荧光倒置相差显微镜和扫描电镜见细胞与支架黏附良好并有大量基质分泌，且活性指标与正常培养的hUCMSCs比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论蚕丝素多孔支架对hUCMSCs具有良好的吸附作用，并能维持其正常形态、功能及活性，蚕丝素多孔支架是hUCMSCs三维立体培养时的良好天然支架。
- 刘毅肖宏涛
- 关键词：脐带间充质干细胞
- 冻存复苏人脐带间充质干细胞体外扩增和向脂肪细胞分化的研究被引量：1
- 2009年
- 目的:分离培养人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells hUCMSCs),观察其冻存复苏后向脂肪细胞定向分化的能力。方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,观察细胞生长及检测其表面抗原。将第1代的hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存5个月,复苏后培养至第12代时,加入成脂诱导剂培养。当诱导至21天时行油红O染色,7天及14天时用RT-PCR技术分别检测成脂转化基因过氧化物酶增殖剂受体(PPARγ-2)和脂蛋白酯酶(LPL)。结果:组织块培养法收获的单个核细胞培养传代后,能获得均一贴壁的间充质干细胞,hUCMSCs冻存复苏后,活细胞约为86%,流式细胞仪分析这些细胞表达CD13、CD44和CD71等MSCs标志物,不表达CD14、CD34和HLA-DR表面抗原。复苏细胞在成脂诱导剂的作用下,细胞中有脂滴产生,通过油红O染色显示细胞核周围有脂滴聚集,通过RT-PCR检测有LPL及PPARγ2mRNA的表达。结论:采用组织块贴壁培养法分离获得的人脐带间充质干细胞可冷冻保存。复苏后培养至第12代仍具有向脂肪细胞分化的潜能,可作为脂肪组织工程种子细胞来源。
- 肖宏涛刘毅陈克明
- 关键词：冻存脐带间充质干细胞分化脂肪细胞
