上海市卫生局青年科研基金(2006Y41)
- 作品数：3 被引量：9H指数：3
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- 相关机构：第二军医大学启东市人民医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子基因感染NIH3T3细胞的实验研究被引量：3
- 2008年
- 目的:探讨腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)基因感染NIH3T3细胞后目的基因表达情况及其对细胞增殖分化的影响,并观察体内移植后的表达情况及其血管生成效应。方法:构建含hVEGF基因重组腺病毒Ad.hVEGF,体外感染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效果和转染率,采用免疫组化、RT-PCR和ELISA法分别检测转染后的NIH3T3细胞VEGF的表达情况。将转染后的NIH3T3细胞移植于小鼠背部皮肤缺损模型上,1周后取创面覆盖的脱细胞真皮组织标本,免疫组化检测组织VEGF的表达,并行组织新生血管计数。结果:携带hVEGF基因的重组腺病毒对于NIH3T3细胞具有较高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicities of infection,MOI)具有量效关系。MOI为100倍时,转染效率达95%。RT-PCR和免疫组化检测到,Ad.hVEGF感染NIH3T3细胞24 h后即可在基因和蛋白质水平表达,ELISA法检测到VEGF第3日表达分泌较高,7 d时达到表达高峰(1052 pg/ml),13 d后仍可检测到VEGF的表达。2周内MTT法动态检测D值,转染组细胞与未转染组细胞比较无显著性差异(P>0.05)。转染细胞体内种植后在组织中亦可明显表达VEGF,实验组新生血管数显著高于对照组(P<0.01)。结论:腺病毒介导的VEGF基因可有效转染NIH3T3细胞,体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生。
- 韩焱福刘军宋建星潘银根黄盛东龚德军
- 关键词：血管内皮细胞生长因子NIH3T3细胞腺病毒细胞增殖细胞分化
- 血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定被引量：5
- 2008年
- 目的:基因重组腺病毒具有较高的转染率,且宿主范围广。实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体(Ad.VEGF165),为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础。方法:实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成(国家级重点实验室)。①实验材料:pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠。②实验方法:采用脂质体转染法,将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞,扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒。③实验评估:应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因。并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度。结果:①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建:采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC有效转染人胚肾293细胞,扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒。②重组腺病毒Ad.VEGF165的鉴定:聚合酶链反应的产物进行NcoⅠ酶切鉴定,可得到597bp、146bp2个片段,与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致,计算病毒滴度为2.2×1015pfu/L。结论:采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全。
- 韩焱福宋建星刘军
- 关键词：血管内皮细胞生长因子腺病毒粘粒同源重组基因治疗
- 微囊化血管内皮细胞生长因子基因修饰NIH3T3细胞的制备及体外培养被引量：3
- 2008年
- 目的:制备微囊化血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰NIH3T3细胞,并研究微囊化技术对VEGF基因修饰NIH3T3细胞增殖及其分泌VEGF功能的影响。方法:应用海藻酸钠-氯化钡技术制备微囊化VEGF基因修饰NIH3T3细胞。并与未微囊化VEGF基因修饰NIH3T3细胞对照培养,在倒置相差显微镜下观察微囊及细胞形态,用MTT法和PI染色流式细胞术检测细胞的增殖及活性情况。每48 h收集微囊化及未微囊化基因修饰NIH3T3细胞培养上清,-20℃保存.ELISA法检测培养上清VEGF的含量。结果:微囊形态较圆整,其内细胞生长良好;两组细胞增殖与活性及培养上清中VEGF含量无统计学差异。结论:微囊化并不影响基因修饰细胞的生长代谢功能,与对照组比较.在体外培养时生物学特性无明显差异,为研究微囊化基因修饰细胞体内移植奠定了基础。
- 韩焱福宋建星刘军尹东锋陈玉林吕川杨硕成娄晓莉
- 关键词：血管内皮细胞生长因子NIH3T3细胞微囊
