国家自然科学基金(30771615)
- 作品数：10 被引量：26H指数：4
- 相关作者：孟庆文王伟胡卫杰张雅春陈洪岩更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所新疆农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金“十一五”国家科技支撑计划国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定被引量：1
- 2020年
- 利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。
- 鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文
- 关键词：H9N2亚型禽流感病毒HEK293细胞基因敲除
- 鸭RIG-1基因的组织表达及体外抗禽流感病毒活性研究被引量：5
- 2013年
- 视黄酸诱导基因蛋白1(RIG-1)是一类模式识别受体,在机体抗病毒天然免疫过程中发挥重要作用。为检测金定鸭RIG-1基因的组织特异性表达水平和体外抗禽流感病毒(AIV)活性,本研究采用RT-PCR方法扩增鸭RIG-1基因并克隆于pcDNA3.1(+)中构建重组真核表达质粒pcDNA-RIG-1,应用荧光定量PCR方法检测该基因在鸭不同组织中的特异性表达水平;并将pcDNA-RIG-1转染DF-1细胞,通过病毒TCID50测定、间接免疫荧光、荧光定量PCR的方法检测RIG-1的抗AIV活性。结果显示,从金定鸭脾脏中扩增的RIG-1基因的CDS序列大小为2 802 bp,编码934个氨基酸;RIG-1基因在不同组织中的表达各不相同,在鸭的脾脏和肾脏中表达量较高,肝脏中度表达,心脏、肺脏和肌肉低度表达;pcDNA-RIG-1转染DF-1细胞组与pcDNA3.1(+)转染组相比,病毒TCID50及相对表达量显著降低,IFN-β及Mx的相对表达量显著升高,表明RIG-1产生了显著的抗AIV作用。本研究为禽类RIG-1蛋白功能和家禽的天然免疫研究奠定了基础。
- 张雅春胡卫杰王建超王伟邓瑞坡李越赵颖慧孟庆文
- 关键词：抗病毒
- 鸡Mx蛋白单克隆抗体的制备及鉴定被引量：2
- 2013年
- Mx蛋白为GTP酶动态蛋白家族成员,已被证明具有抗禽流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的作用。为制备鸡Mx蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的鸡Mx蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得4株稳定分泌抗鸡Mx蛋白抗体的杂交瘤细胞株。间接ELISA测定4株MAb纯化后腹水的效价介于1∶3.2×104～1∶2.5×105之间。Western blot结果证实4株MAb均具有良好的反应性;间接免疫荧光试验表明其中一株MAb与真核表达的鸡Mx蛋白发生反应。本研究为鸡Mx蛋白功能及表达鸡Mx蛋白的转基因动物等研究奠定了基础。
- 胡卫杰王伟孙建华邓瑞坡张雅春尹海畅孟庆文
- 关键词：MX蛋白单克隆抗体
- ICR小鼠Mx1基因的克隆及组织表达被引量：4
- 2011年
- 为了对ICR小鼠的Mx1基因序列特征进行比较分析,揭示该基因的组织特异性表达规律,用干扰素诱导剂poly（I）/（C）诱导小鼠腹腔巨噬细胞,应用RT-PCR技术克隆小鼠Mx1基因全长编码区序列,并用半定量RT-PCR方法研究该基因在组织中的特异性表达规律。结果显示,从雌性ICR小鼠腹腔巨噬细胞中克隆的Mx1基因的CDS序列大小为1 611 bp,编码536个氨基酸。该序列与其他物种Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为37.36%~69.98%,氨基酸同源性为38.8%~76.6%。半定量RT-PCR显示,Mx1基因在所检测组织的脾脏、肺脏中表达量较高,肝脏中度表达,心脏、肾脏低度表达,肌肉中不表达。研究结果表明,克隆的Mx1基因所编码的蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征,该基因的表达具有组织特异性。
- 肖志广刘晓敏王丽李巍王伟胡卫杰王建超孟庆文
- 关键词：小鼠基因克隆
- 鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护
- 2018年
- 鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。
- 李亚芳赵颖慧刘赛宝王伟曾为俊王金泉陈洪岩孟庆文
- 关键词：HA禽流感病毒免疫保护
- 维甲酸诱导蛋白Ⅰ在禽类抗病毒天然免疫中的研究进展被引量：2
- 2013年
- 维甲酸诱导蛋白Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)是机体先天性免疫系统中的一类重要受体,能识别细胞中的外源RNA,诱导Ⅰ型干扰素、细胞因子及趋化因子的产生,对机体抗病毒天然免疫的建立有重要作用。研究结果发现,RIG-Ⅰ在哺乳动物中能抑制流感病毒和新城疫病毒等病毒。鸡体内不含有RIG-Ⅰ,鸭RIG-Ⅰ能在鸡源细胞系中产生显著的抗禽流感病毒效果。作者重点论述了RIG-Ⅰ的作用机制,展望了RIG-Ⅰ在提高禽类抗病力和推进禽类先天性免疫基础研究方面的潜力。
- 张雅春王伟孟庆文
- 关键词：禽类天然免疫抗病毒
- 鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析被引量：7
- 2008年
- 用干扰素诱导剂poly（I）／（C）诱导鸡胚成纤维细胞，提取细胞总RNA，采用RT—PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列。序列分析表明：该基因编码区长2118bp，编码705个氨基酸残基，其第631位为天冬酰胺，理论上推测具有抗病毒活性。通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析，结果显示，北京白鸡Mx基因与WL—N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近。北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示，核苷酸同源性为49．5％～76．8％，氨基酸同源性为44．1％～61．6％。据此可以推断：克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构，不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关。
- 李文超王文娟孟庆文冉多良司昌德韩凌霞曲连东
- 关键词：MX基因抗病毒活性禽流感病毒
- 鸡Mx基因的表达及其抗血清的制备被引量：5
- 2009年
- Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性。本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中。以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应。以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性。抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础。
- 谭复善李文超崔雷刘丹秦红刚孟庆文
- 关键词：MX基因原核表达抗血清
- miRNA表达载体的构建与抑制禽流感病毒(AIV)复制的研究
- miRNA是一类内源性的长约21nt～25nt的短序列非编码单链RNA,可以通过部分互补或者完全互补结合到目的靶mRNA,以诱发蛋白质翻译抑制(翻译抑制子)或者介导目的mRNA的降解调节基因表达。根据这一特性,设计靶向禽...
- 孟庆文刘丹秦红刚李文超曲连东
- 关键词：MIRNA病毒抑制
- 文献传递
- 表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测被引量：1
- 2010年
- 慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。
- 田进张在平孟庆文谭复善崔雷
- 关键词：RNAI多靶点慢病毒
