国家自然科学基金(30840010)
- 作品数：4 被引量：28H指数：2
- 相关作者：徐忠伟徐瑞成陈小义呼文亮王凤梅更多>>
- 相关机构：武警医学院天津市第三中心医院中国人民武装警察部队医学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金天津市应用基础与前沿技术研究计划天津市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Na＋／K＋-ATP酶α1亚单位小干扰RNA和哇巴因诱导肝癌HepG2细胞S期阻滞及其机制被引量：3
- 2010年
- 目的观察哇巴因联合Na＋／K＋-ATP酶（钠泵）011亚单位小干扰RNA（siRNA）对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。方法分析人肝癌临床组织标本、正常肝组织和肝癌细胞系SMC7721、Bel7402和HepG2细胞钠泵α1亚单位的表达。CCK-8法检测采用钠泵0L1亚单位siRNA和哇巴因作用肝癌HepG2细胞增殖抑制状况，分析各组细胞的钠泵活性变化，流式细胞术分析细胞周期变化。实时定量PCR和蛋白质印迹法检测钠泵仅1、促分裂源活化蛋白激酶1（MAPK1）、细胞围期蛋白1（CyclinA）、周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白抑制因子（P21WAFI）表达的变化。结果肝癌组织标本的钠泵α1亚单位密度值（174．7±16．8）明显高于正常肝组织（65．3±7．9，P〈0．05）；HepG2细胞钠泵α1亚单位表达明显高SMMC-7721和Bel-7402细胞（P〈0．05）。siRNA、哇巴因和联合用药可抑制HepG2细胞的增殖，联合实验组效果更显著（P〈0．05），0．03μmol／LsiRNA组、0．1μmol／L哇巴因和联合实验组细胞24、48和72h抑制率分别为17．4％、20．3％、24．3％，37．5％、44．3％、51．2％，52．3％、70．2％、88．2％。各实验组均出现钠泵活性降低，以联合实验组最显著（P〈0．05）。0．1μmol／哇巴因和联合实验组HepG2细胞S期比例从24．2％上升至66．5％和75．2％；实时定量PCR和蛋白质印迹检测显示哇巴因组和联合实验组P21“”＋表达上调而钠泵d1亚单位、MAPKl、CyclinA、CDK2和PCNA表达下调。结论钠泵仅1亚单位siRNA联合哇巴因抑制HepG2细胞钠泵后可抑制细胞增殖，而P21WAF1表达上调和CyclinA／CDK2／PCNA周期调控复合体生成减少可能是引起s期阻滞的主要原因。
- 徐忠伟王凤梅徐瑞成呼文亮陈小义
- 关键词：肝细胞哇巴因RNA干扰
- 钠钾泵抑制剂通过调节细胞周期相关蛋白的生成介导肝癌HepG2细胞周期S期阻滞与凋亡被引量：25
- 2010年
- 目的研究钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)和华蟾毒配基(cinobufogenin)对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用及细胞周期的改变,初步分析其机制。方法以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,MTT比色法检测哇巴因和华蟾毒配基对HepG2细胞增殖的影响;Hoechst 33342荧光染色检测细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期;实时定量PCR和Western blot检测CyclinA1、CDK2、PCNA和p21CIP1表达的变化。结果哇巴因和华蟾毒配基可明显抑制HepG2细胞增殖,抑制作用呈时间-浓度依赖性。荧光染色显示药物处理24h后,细胞呈现典型的凋亡形态特征;细胞周期分析显示,实验组S期细胞比例升高,实时定量PCR和Western blot结果显示:哇巴因和华蟾毒配基可下调CyclinA1、CDK2和PC-NA的表达(P<0.05),上调p21CIP1的表达(P<0.05)。结论钠泵抑制剂可抑制肝癌HepG2细胞的增殖,引起细胞周期S期阻滞,诱导细胞凋亡,这与其调节细胞周期相关蛋白的生成关系密切。
- 高默杰徐忠伟王凤梅陈小义呼文亮徐瑞成
- 关键词：哇巴因细胞周期细胞周期相关蛋白钠泵
- 哇巴因和华蟾毒配基通过调节ERK信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究被引量：1
- 2010年
- 目的:通过检测钠钾泵(Na+/K+-ATPase)抑制剂哇巴因和华蟾毒配基对肿瘤细胞存活的影响,研究其通过调节ERK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法:以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,检测Na+/K+-ATPase的活性变化,Hochest33342荧光染色检测细胞形态学变化;单细胞电泳检测细胞DNA损伤程度,钙离子荧光探针检测Ca2+浓度变化;Westernblot检测Caspase-3、ERK的表达变化。结果:哇巴因和华蟾毒配基可抑制Na+/K+-ATPase的活性;可使HepG2细胞呈典型的凋亡形态特征;单细胞电泳显示其可损伤HepG2细胞DNA双链;Fluo-3AM检测显示哇巴因和华蟾毒配基促进了Ca2+浓度增高;Western blot显示其可促进Caspase-3的活化,上调ERK磷酸化水平。结论:Na+/K+-ATPase抑制剂可诱导肝癌HepG2细胞凋亡,导致细胞DNA损伤,诱导细胞内游离Ca2+浓度增高,促进细胞凋亡途径中主要蛋白Caspase-3的活化。而ERK信号通路在哇巴因和华蟾毒配基诱导的HepG2细胞凋亡过程中发挥着关键调控作用。
- 高默杰徐忠伟王凤梅陈小义呼文亮徐瑞成
- 关键词：哇巴因HEPG2细胞细胞凋亡游离钙离子
- 从噬菌体7肽库中筛选的哇巴因结合肽对血管内皮细胞的保护作用被引量：1
- 2009年
- 目的:寻找与哇巴因高亲和力结合并抑制其生物功能的相关小分子肽,为治疗原发性高血压提供新策略。方法:以哇巴因为筛选分子,应用M13噬菌体呈现随机7肽库进行筛选。经过3轮生物淘筛,并通过ELISA法鉴定,对噬菌体阳性克隆ssDNA电泳鉴定和基因测序分析。委托合成筛选获得哇巴因结合肽,采用放射配基受体结合法检测其结合活性;MTT法检测血管内皮细胞的增殖抑制率,Hoechst33342/PI双荧光染色检测细胞形态学变化;利用RT-PCR和细胞免疫荧光检测钠泵α1、β1的表达水平;荧光探针检测细胞内游离Na+浓度变化。结果:筛选获得14个阳性克隆,基因测序显示:哇巴因结合肽一致率达64.3%(9/14)。委托合成肽(Arg-Cys-Met-Thr-Ser-Arg-Ser)。放射性配基受体结合法检测显示,合成的哇巴因结合肽能够与哇巴因结合。哇巴因结合肽+哇巴因的EAhy926细胞组增殖抑制率小于哇巴因组(P<0.05);Hoechst33342/PI双荧光染色显示细胞死亡数量减少;RT-PCR和免疫细胞化学检测钠泵α1、β1亚单位转录和翻译水平,显示哇巴因结合肽能拮抗哇巴因所引起钠泵α1亚单位表达的上调、β1亚单位的下调作用;荧光探针显示哇巴因结合肽能够拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用。结论:哇巴因特异性结合肽能够阻抑哇巴因对血管内皮细胞的抑制增殖和诱导死亡作用,为研究哇巴因与钠泵的相互作用机制及进一步研究抗哇巴因的分子药物奠定基础。
- 徐忠伟徐瑞成陈小义刘英富
- 关键词：哇巴因噬菌体展示肽库结合肽血管内皮细胞细胞死亡
