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稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立被引量：1: 2013年; 在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.; 方彧聃何佳平张斯敏王娟任晓叶张金脉张敬之; 关键词：催乳素乳腺生物反应器

慢病毒载体转录通读率检测方法的建立被引量：1: 2013年; 慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法。文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物。两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率。说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持。; 何佳平方彧聃张帆孙凤强王娟张敬之; 关键词：慢病毒载体安全性

病毒滴度和插入子长度对慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响: 2013年; 目的研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响。方法制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体，通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠，然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率，并对所生成的数据进行统计学分析。结果插入子长度在较短（〈2kb）的情况下，病毒滴度达到2×10^8就可获得较高的整合率，在插入子长度稍长（4-5kb）的情况下，需要1×10^9滴度才能获得较高的整合率，而在插入子长度大于6kb的情况下，未能用该方法获得转基因小鼠。结论滴度的增加能有效提高慢病毒载体制备转基因小鼠的整合率，而当滴度适中（-2×10^8）时，整合率随插入子长度的增加而下降。; 郭歆冰龚秀丽陈雁雯方彧聃张敬之; 关键词：慢病毒载体转基因小鼠滴度

以HIV-1为骨架的慢病毒载体在其假病毒的转录本中保留其内含子不被剪切: 2011年; 通过在FUGW中克隆入各外源基因表达盒,如红系特异表达人β珠蛋白(HBG),或山羊乳腺特异表达人血清白蛋白(pBLG-ALB)等,研究以HIV-1为骨架的慢病毒载体FUGW在其假病毒的转录本中内含子的剪切情况.将慢病毒载体制备成假病毒后抽提其病毒RNA,通过逆转录和PCR验证其内含子剪切保留情况;同时,在相对应的慢病毒假病毒介导的转基因小鼠中也进行类似的PCR验证.在制备假病毒的转录过程中,其外源基因所携带的內含子在病毒所包含的基因组RNA中被部分保护不被剪切,且优先保护5′端的内含子.此现象正好与野生型HIV-1的保护顺序相反.; 张帆方彧聃张敬之; 关键词：艾滋病毒慢病毒载体内含子剪切

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上海市自然科学基金(11ZR1429900)