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猪PGAM2基因的克隆、序列特征及表达分析被引量：5: 2008年; 克隆了猪PGAM2基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行分析。所得cDNA序列全长913 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码253个氨基酸。序列分析表明,该基因预测编码蛋白与已报道的狗（97.6%）、人（96%）、黑猩猩（96%）、大鼠（94.5）和小鼠（94.1%）等物种的PGAM2蛋白高度同源其在N端和C端分别存在1个ATHR和QGKA模体,在14~15AA处存在1个信号肽切割位点,含有1个典型的碳水化合物运输和代谢（GPMA）保守结构域。该基因在猪胚胎骨骼肌发育过程中差异表达,且在通城猪和长白猪中呈现不同表达模式。在通城猪中,PGAM2基因呈波浪式表达,即妊娠65 d时表达水平最高,且各时间点表达水平差异极显著（P〈0.01）。在长白猪中呈上调表达模式,妊娠65和90 d时表达丰富,且极显著高于妊娠33 d（P〈0.01）。品种间比较来看,在妊娠33和65 d时两品种表达水平相当,但妊娠90 d时长白猪中的表达水平极显著高于通城猪（P=0.006）。; 伍晓雄唐中林李勇杨述林储明星马月辉李奎

转基因小鼠的多重PCR快速检测技术被引量：5: 2009年; 转基因检测技术的标准化可以为转基因法规的制定和转基因产品的标识提供技术支持。采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组DNA,用PCR方法检测其中的外源基因结构如cytomegalovirus(CMV)启动子、hGH polyA终止子及目的基因跨膜蛋白66(Transmembrane protein 66,Tmem66),筛选到阳性样品。优化了多重PCR引物退火温度及缓冲液浓度,并探讨了扩增速率对多重PCR的影响。结果表明,此多重PCR方法可得到很好的扩增效果,可用于转基因小鼠外源基因的检测,同时为哺乳动物检测标准的建立提供参考。; 王趁芳李新云王志伟敖红崔文涛李奎; 关键词：转基因小鼠多重PCR

猪IκBα基因定点突变中两种方法的应用被引量：2: 2009年; 作者将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸,为进一步研究突变型IκBα蛋白对异种移植延缓性排斥反应的抑制机理奠定基础。首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。说明两种突变方法各有所长,又有各自的缺点,应根据试验的实际需要灵活选择合适的突变方法,以收到事半功倍的效果。; 李和刚傅田靳二辉操继跃李奎肖邦杨述林; 关键词：定点突变重叠延伸PCR

小鼠四倍体囊胚凋亡及凋亡基因的表达: 2010年; 为了更全面的对四倍体胚胎的发育能力进行评估,本研究利用原位末端标记(TUNEL)法检测了电融合生产的小鼠四倍体囊胚细胞凋亡情况,同时用实时定量PCR方法检测了促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2在四倍体囊胚中的表达。结果显示:四倍体与体外二倍体胚胎发育到囊胚的比率没有显著差别(P>0.05);四倍体囊胚无论是内细胞团细胞数、滋养层细胞数还是内细胞团/总细胞数比率都显著低于体内与体外二倍体囊胚(P<0.05);四倍体囊胚细胞凋亡指数显著高于体内与体外二倍体囊胚细胞凋亡指数(P<0.05);促凋亡基因Bax在四倍体囊胚中的表达显著高于体内与体外二倍体囊胚中的表达(P<0.05),而抑凋亡基因Bcl-2在四倍体囊胚中的表达同体内与体外二倍体囊胚中的表达没有显著差异(P>0.05)。因此,四倍体囊胚质量比体内与体外二倍体囊胚质量都差,这可能是四倍体胚胎不能发育到足月的原因之一。; 员新旭冯书堂牟玉莲李奎; 关键词：四倍体囊胚细胞凋亡

猪TIMP-2基因克隆、序列特征和表达分析被引量：1: 2009年; 本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能。将人TIM-P2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况。结果,猪TIM-P2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸。多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性。蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu)。结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构。表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺3、3 d胚胎中中度表达。结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能。; 黄宏刚肖邦任红艳唐中林杨述林崔文涛牟玉莲储明星李奎; 关键词：TIMP-2 电子克隆表达谱

利用酵母双杂交系统筛选猪Calsarcin-1基因相互作用蛋白被引量：5: 2009年; 【目的】利用酵母双杂交系统研究与猪Calsarcin-1相互作用的蛋白,了解Calsarcin-1在猪骨骼肌纤维类型形成和信号通路的调控功能。【方法】首先用长白猪Calsarcin-1基因构建既无自激活性又无毒性的pGBKT7-CS1诱饵载体;然后从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA;最后通过酵母双杂交系统的共转化法筛选与Calsarcin-1相互作用的蛋白,在GenBank中比对分析相互作用基因,分析Calsarcin-1在骨骼肌中的功能。【结果】构建了pGBKT7-CS1诱饵载体,获得具有完整3′端的猪骨骼肌单链cDNA,并合成双链cDNA。筛选出4个与Calsarcin-1相互作用的蛋白,经与人的基因比较分析,发现Calsarcin-1与α-1肌动蛋白和α-3辅肌动蛋白互作,与骨骼肌Z线附近结构形成有关;与肌集钙蛋白-1和肌钙蛋白T3互作,影响钙离子的调控。【结论】分析所筛选出的蛋白功能,推测Calsarcin-1通过结合这些蛋白,维持细胞结构的稳定,影响相关蛋白的钙离子结合能力,从而参与钙离子调控;而钙离子浓度的变化将影响到其它控制肌纤维分化的因子,或其它调控通路,共同调节快慢肌纤维的形成与转化。; 杨锷朱文娟伍晓雄杨述林李奎牟玉莲崔文涛储明星马月辉; 关键词：骨骼肌酵母双杂交

猪MSTN前肽定点诱变载体在C2C12细胞中的表达被引量：1: 2009年; 本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性。以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序。再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上。通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞。转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况。结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高。这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料。; 张晓玮崔文涛伍晓雄杨述林牟玉莲唐中林李奎; 关键词：定点诱变真核表达

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国家高技术研究发展计划(2006AA10Z135)

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