广东省科技计划工业攻关项目(2007B31509007)
- 作品数：6 被引量：18H指数：3
- 相关作者：许立新肖慧佘守章丁宁高巨更多>>
- 相关机构：广州市第一人民医院广州中医药大学广东省中医院更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目广州市医药卫生科技项目广东省医学科学技术研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测
- 2009年
- 目的构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体。方法采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1P。经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应。以转染空载体pDsRed1-1的细胞作为对照。结果PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRed1-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。转染空载体pDsRed1-1的细胞未见红色荧光。结论成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1红色荧光蛋白机械牵张
- HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的:构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞(A549)后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法:以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张(分别为5%和20%)刺激下荧光素酶的活性变化.结果:PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍(P<0.05);而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍(P<0.01).结论:利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：机械牵张高迁移率族蛋白1
- 丙泊酚抑制机械牵张诱导的肺泡上皮细胞HMGB1启动子转录激活被引量：5
- 2009年
- 目的探讨丙泊酚对机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 pro-tein,HMGB1)启动子转录激活的影响。方法以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P。采用脂质体介导的细胞转染技术将pGL3-HMGB1P和空载体pGL3-Basic分别转染A549细胞,以机械牵张和机械牵张+丙泊酚分别处理转染后的A549细胞,检测并比较荧光素酶活性,分别用Western blot和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达。结果酶切和测序结果证实重组载体pGL3-HMGB1P构建正确,荧光素酶活性检测显示重组载体pGL3-HMGB1P在A549细胞中有效表达。与未牵张组比较,牵张组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显增加(P<0.05);与牵张组比较,牵张+丙泊酚组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显降低(P<0.05)。结论丙泊酚在转录水平通过抑制机械牵张诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达,可能是丙泊酚防治机械牵张引起炎症反应的机制之一。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：丙泊酚机械牵张肺泡上皮细胞转录活性启动子
- 应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白被引量：5
- 2010年
- 目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白1启动子噬菌体展示肽库基因表达调控
- 晚期糖基化终产物受体胞外段的原核表达及其相互作用蛋白的筛选被引量：2
- 2009年
- 目的构建晚期糖基化终产物受体(receptor for ad-vanced glycation end-product,RAGE)胞外段基因的原核表达载体并诱导表达,应用噬菌体展示技术筛选其相互作用蛋白。方法用RT-PCR方法扩增人RAGE胞外段cDNA,构建于原核表达载体pET14b,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导RAGE胞外段融合蛋白表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化并行Western blot鉴定。以重组RAGE胞外段蛋白为靶分子,进行3轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选分隔良好的噬菌体克隆扩增后进行ELISA鉴定。对获得的阳性噬菌体克隆分别进行扩增、纯化,提取DNA测序后翻译为氨基酸序列,用BLAST软件搜索Gen-Bank中的同源序列。结果成功构建并表达、纯化了RAGE胞外段融合蛋白。经过3轮筛选后,随机挑取的24个噬菌体克隆中11个可与RAGE胞外段结合。对11个噬菌体测序后用BLAST软件搜索同源序列,得到14个编码蛋白。结论应用噬菌体展示技术筛选到与RAGE胞外段相互作用的蛋白,为进一步研究其功能和作用机制提供新线索。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：糖基化终产物受体噬菌体展示肽库
- p38MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞表达HMGB1中的作用被引量：5
- 2009年
- 目的:研究p38 MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞(AM)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法:大鼠AM随机分为A、B、C3组,A组为对照组;B组细胞施加20%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,在牵张前用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(40μmol/L)预处理2h。利用RT-PCR法检测HMGB1 mRNA的表达,Western blotting检测HMGB1蛋白表达和p38 MAPK的活性。结果:与对照组相比,AM施加20%牵张应变可诱导HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加、p38 MAPK活性明显增高(均P<0.05),SB203580可显著抑制牵张应变的这种诱导作用(均P<0.05)。结论:周期性机械牵张可能通过p38 MAPK信号通路,调节肺泡巨噬细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：机械牵张P38MAP激酶肺泡巨噬细胞
