国家自然科学基金(81071373)
- 作品数：8 被引量：20H指数：3
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- 弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞(HFF)进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。结果经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确;经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定,AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达。结论成功构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达。
- 石娜何深一陈琳周怀瑜丛华白杨赵广会赵群力
- 关键词：弓形虫属质粒细胞转染
- 弓形虫棒状体蛋白7真核表达载体的构建及其免疫保护作用被引量：1
- 2015年
- 目的构建弓形虫棒状体蛋白7(ROP7)基因的真核重组表达载体,观察其对小鼠的免疫保护作用。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP7序列设计合成一对引物,通过PCR扩增ROP7基因,将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒pEGFP-C1/ROP7(pROP7)。用重组质粒转染HEK293T细胞并验证其在细胞内的表达。将36只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组、pEGFP-C1对照组和pROP7实验组。然后用PBS、pEGFP-C1和pROP7分别免疫相应组别的小鼠。采用ELISA检测小鼠血清特异IgG水平,观察弓形虫感染小鼠后的存活时间并评价其免疫保护力。结果PCR扩增出1 728 bp的目的基因片段,真核表达载体构建成功,且能在HEK293T细胞中表达。目的基因的相应蛋白可被羊抗弓形虫多克隆抗体识别。重组质粒免疫的小鼠产生了较高水平的血清抗体。虫体攻击试验中,pROP7实验组小鼠的生存时间较对照组小鼠延长(P<0.05)。结论本研究构建的真核表达质粒在对抗弓形虫感染时具有一定的免疫保护作用,为弓形虫基因疫苗的研制提供了参考。
- 王琳吕刚韩亚莉郭晶晶赵群力何深一
- 关键词：刚地弓形虫核酸疫苗免疫保护
- 弓形虫ROP19蛋白生物信息学分析及真核表达载体的构建被引量：1
- 2017年
- 目的构建刚地弓形虫PRU株ROP19蛋白的真核表达载体并检测其表达。方法利用生物信息学方法分析弓形虫ROP19蛋白的理化性质并比较弓形虫蛋白ROP19和SAG1的B细胞表位及T细胞表位,采用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pEGFP-C1-ROP19(pROP19),经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确后,体外转染HEK293T细胞,置于倒置荧光显微镜下观察荧光的表达情况。细胞转染质粒48 h后收集裂解细胞,提取蛋白后用Western blotting检测重组真核表达质粒pROP19在体外细胞中的表达。结果生物信息学分析显示ROP19主要位于膜上,具备比弓形虫SAG1更优异的抗原表位;RT-PCR结果表明重组真核载体pROP19成功构建,Western blotting结果显示ROP19蛋白可以被抗STAG小鼠血清识别。结论成功获得重组真核表达质粒pROP19,并能在真核细胞内表达。
- 周剑赵晗婷吕刚王琳李启航朱美艳王志林何深一
- 关键词：刚地弓形虫真核表达生物信息学
- 弓形虫ROP31基因克隆及生物信息学分析被引量：6
- 2018年
- 目的构建弓形虫ROP31基因重组真核表达载体,对其编码的蛋白进行生物信息学分析。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,采用PCR扩增ROP31基因,构建其真核表达载体pET30a-ROP31。通过生物信息学软件结合在线程序分析ROP31基因编码蛋白的理化性质、抗原表位、空间结构等。结果 ROP31基因PCR扩增产物大小约1500bp,与预期一致,构建的重组质粒经双酶切鉴定表明目的基因插入正确。生物信息学分析ROP31基因编码蛋白有多个磷酸化修饰位点,具备多个跨膜区域;二级结构和空间结构分析ROP31蛋白与ROP家族优秀DNA疫苗ROP5、ROP17、ROP18在结构上相似;IEDB在线程序及DNA MAN软件分析ROP31蛋白具备比SAG1更为优秀的线性T、B细胞表位。结论成功构建重组真核表达载体pROP31,生物信息学分析其编码的ROP31蛋白具备优秀的细胞表位,这将为弓形虫ROP31DNA疫苗的研究提供理论依据。
- 周剑何深一刘晓雨王琳吕刚宋鹏霞韩雅丽郝珍郭晶晶朱曦杜辖东周琼彭倩
- 关键词：刚地弓形虫真核表达载体生物信息学
- 刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达被引量：6
- 2012年
- 目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒pcDNA3.0/14-3-3,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人宫颈癌(HeLa)细胞,蛋白印迹(Western blotting)分析表达产物。结果根据14-3-3蛋白基因片段序列和氨基酸序列预测,该蛋白分子为酸性可溶性蛋白,主要以同源或异源二聚体存在,有5个氨基酸保守序列区。RT-PCR的扩增产物约为800 bp,构建的真核表达质粒pcDNA3.0/14-3-3插入片段经测序,片段长度为801 bp,与GenBank中刚地弓形虫14-3-3蛋白基因序列(登录号为AB012775.1)同源性为99%。Western blotting分析结果显示,在转染pcDNA3.0/14-3-3的细胞中,有14-3-3蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,且表达量显著高于转染空质粒和未转染的细胞。结论构建了真核表达载体pcDNA3.0/14-3-3,并能在真核细胞内表达。
- 孙敏何深一赵广会丛华周怀瑜赵群力孟敏
- 关键词：刚地弓形虫真核表达生物信息学
- 弓形虫主要抗原及核酸疫苗研究进展被引量：2
- 2011年
- 弓形虫分布广泛,且人畜感染弓形虫会带来很严重的后果,所以弓形虫病的防治一直困扰着各国学者。近年来,随着对弓形虫研究的深入以及分子生物学的发展,弓形虫核酸疫苗的研究也取得了较大的进展。本文综述了弓形虫主要抗原以及弓形虫核酸疫苗的研究现状,探索弓形虫疫苗的发展前景,并对核酸疫苗的优缺点进行讨论。
- 白杨何深一
- 关键词：弓形虫病表面抗原核酸疫苗
- 弓形虫ROP18-MIC2重组真核质粒的构建与表达被引量：3
- 2012年
- 目的构建弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和微线体蛋白2(MIC2)的基因融合的重组真核表达质粒,并在转录和翻译水平进行鉴定。方法利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,体外转染人包皮成纤维细胞(HFF),采用RT-PCR在48 h时检测转录水平,SDS-PAGE在72 h时检测蛋白表达。结果重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2构建正确,经RT-PCR、SDS-PAGE鉴定,弓形虫ROP18、MIC2可在HFF细胞中瞬时表达。结论成功获得重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。
- 陈琳何深一石娜周怀瑜丛华白杨赵广会赵群力
- 关键词：弓形虫属真核细胞
- RNA干扰及在刚地弓形虫研究中的应用
- 2012年
- 刚地弓形虫病严重危害人类健康,是非常严重的公共卫生问题,弓形虫病的防治刻不容缓,寻找安全有效的防治措施是控制弓形虫病的重点和难点。RNA干扰技术可以抑制特定基因的表达,具有普遍性、高效性、特异性等优点,是研究弓形虫基因组功能、筛选新的疫苗和药物靶点的强有力的工具。本文综述了近几年来RNA干扰的研究进展及其在刚地弓形虫研究中的应用。
- 孟敏何深一
- 关键词：RNA干扰小干扰RNA刚地弓形虫
