国家自然科学基金(81273325)
- 作品数：6 被引量：11H指数：2
- 相关作者：朱进冯振卿熊四平仇镇宁张晓更多>>
- 相关机构：中国人民解放军南京军区军事医学研究所南京医科大学江阴力博医药生物技术有限公司更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省社会发展科技计划江苏省科技支撑计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定被引量：2
- 2017年
- 目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源Ig M转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定。方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源Ig M转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定。结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1、6H11、9A3、15D6、19E6,均为人源Ig M免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合。结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础。
- 王晓蕾朱进哈卓张晓萍杨岚杨晓明刘云成Mason Lu冯振卿
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白
- 人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定被引量：4
- 2016年
- 目的 :将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体Ig G,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性。方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建全分子Ig G抗体重、轻链表达载体,共转染293 Free Style(293F)细胞,表达并纯化Ig G抗体。应用ELISA及Western blot实验检测抗体免疫学活性,微量中和实验及鸡胚预防保护实验检测其中和活性,血凝抑制试验判断其结合血凝素亚基。结果:成功筛选出1株全人源抗H7N9血凝素Fab抗体基因并构建Ig G真核表达载体。获得的全分子Ig G抗体重、轻链序列正确,并可特异性结合H7N9血凝素。微量中和实验证明其对H7N9型禽流感病毒有良好中和活性,中和滴度为15.6μg/m L。鸡胚预防保护实验显示抗体用量为200μg时可达100%保护率。血凝抑制试验表明其结合血凝素HA2亚基。结论:制备的重组全人源全分子抗H7N9血凝素Ig G抗体可特异性识别H7N9型禽流感病毒血凝素,对H7N9型禽流病毒有显著的中和作用,为进一步研发用于禽流感防治的抗体药物奠定基础。
- 陈雅熊四平唐奇王怡雯耿以如顾慧徐亚如周荧仇镇宁冯振卿朱进
- 关键词：血凝素中和抗体
- 狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析被引量：2
- 2015年
- 目的 :利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆、表达、纯化,并对重组RVG进行免疫学特性鉴定。方法:参照Gen Bank收录的狂犬病病毒CVS-11株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因。RVG基因经Bam HⅠ/KpnⅠ双酶切后定向克隆到p Fast Bac-GP67B载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组穿梭载体r Bacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达。His-Trap HP纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性。结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000。经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性。结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础。
- 王晓蕾陈芳芳袁伟钱国强耿以如张晓杨瑾熊四平陈雅唐奇仇镇宁冯振卿朱进
- 关键词：狂犬病病毒狂犬病病毒糖蛋白纯化抗体
- 全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定被引量：5
- 2013年
- 目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。
- 张倩倩赵茜张晓丁贵鹏金秋高畅熊四平陈玉平朱进冯振卿
- 关键词：噬菌体抗体库中和活性
- 人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定
- 2016年
- 目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体。应用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性。结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg。结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用。
- 耿以如熊四平唐奇张晓陈雅徐亚如周荧仇镇宁冯振卿朱进
- 关键词：狂犬病毒中和活性
- 全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体的制备及活性分析被引量：2
- 2014年
- 目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性。方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体。以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性分析。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,经测序分析正确后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在加入浓度为0.5 mmol/L IPTG时,scFv-Fc融合抗体的表达较高,其分子量大小为57 000。纯化后的scFv-Fc融合抗体在1∶512的条件下仍可以较好地结合狂犬病病毒。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,表达并纯化了scFv-Fc融合抗体,为研发狂犬病暴露后预防治疗性抗体药物奠定了基础。
- 高畅张倩倩熊四平唐小军仇镇宁冯振卿朱进
- 关键词：狂犬病病毒
