国家自然科学基金(31272528)
- 作品数：11 被引量：17H指数：3
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- 去泛素化酶UL36的抑制剂LDN57444抑制马立克氏病病毒的增殖被引量：2
- 2022年
- 马立克氏病病毒(MDV)引起的鸡马立克氏病(MD)可用疫苗进行防御,但疫苗无法阻止MDV对鸡的感染以及MDV的传播和毒力的增强,MD仍为养禽业的重要威胁。而抑制细胞内MDV增殖是增强疫苗防御效果的重要策略,化学药物无疑是重要的选择之一。本研究在前期研究基础上,以MDV编码的去泛素化酶UL36为靶点,经高通量筛选,从蛋白酶抑制剂库中筛选出对UL36去泛素化酶的活性具有抑制作用的化合物LDN57444,应用酶抑制动力学方法揭示,LDN57444以非竞争性方式抑制UL36去泛素化酶活性,IC_(50)为3.10μmol/L。同源建模结合分子对接分析发现,LDN57444结合于UL36-480的C末端口袋中,通过氢键、Pi-Sigma作用、Pi-Pi堆积作用、Pi-Alkyl作用等方式与UL36-480互作,进而抑制UL36-480的活性。进一步在细胞水平,应用MDV致CEF的CPE模型分析LDN57444对MDV在CEF细胞中的增殖的抑制作用,结果发现,5,20μmol/L的LDN57444可显著抑制CPE的形成,并抑制MDV在CEF细胞内的增殖(P<0.01)。同时,应用MD鸡模型分析LDN57444是否可以抑制MDV在鸡体内的增殖,结果发现,每日高于0.5 mg/kg给药可显著抑制MDV在鸡体内的增殖(P<0.01)。本研究结果表明,化合物LDN57444可以抑制MDV在细胞及动物体内增殖,为进一步研制抗MD药物提供了可靠的依据。
- 王文婧范青松刘宇航王婷邓国辉谢知航王梦涵吕岩许家翠艾永兴
- 关键词：马立克氏病病毒
- 鸡chUSP1 His594Ala突变使其去泛素化酶活性丧失
- 2015年
- 泛素特异性蛋白酶1(ubiquitin-specific proteases 1,USP1)是一种去泛素化酶,它在DNA损伤修复应答过程中发挥重要功能。已证明USP1与UAF1(USP1-associated factor 1)形成复合物后,其酶活性会得到极大的提升。chUSP1为在鸡细胞中发现的一种去泛素化酶,生物信息学分析发现它与人USP1同源性高达72%。本研究以本室扩增的chUSP1基因和chUAF1基因,使用bac-to-bac系统表达了chUSP1GG680,681AA单体及chUSP1GG680,681AA/chUAF1复合体。并根据人USP1预测将chUSP1一个可能的活性中心位点第594位组氨酸突变为丙氨酸,并纯化了此突变型的单体和复合体。应用底物Di-Ub/Ub2 WT Chains(K63-linked)及Di-Ub/Ub2 WT Chains(K48-linked)对chUSP1GG680,681AA和突变型chUSP1HGG594,680,681AA进行酶活性分析。试验结果表明chUSP1具有切割Ub链底物的酶活性,且第594位组氨酸残基突变影响chUSP1的去泛素化酶活性。而chUAF1可以与chUSP1相互作用形成复合体,并且明显提高chUSP1酶活性。
- 郑海南赵程程邓晨于佩峰王梦云吴山力吕岩艾永兴
- 关键词：杆状病毒昆虫细胞酶活性分析
- 去泛素化酶抑制剂b-AP15抑制马立克氏病病毒的复制被引量：1
- 2021年
- 为了探寻对马立克氏病病毒(MDV)增殖具有靶向抑制作用的药物,本研究以MDV编码的去泛素化酶UL36为靶点,利用去泛素化反应体系,对2448个化合物进行筛选,应用泛素荧光底物分析抑制物对UL36的抑制动力学,并应用MDV致鸡胚成纤维细胞(CEF)病变模型(CPE)和MDV致鸡马立克氏病(MD)模型分析抑制物对MDV在鸡细胞中复制的影响。结果发现,化合物b-AP15在高于5μmol/L浓度时可显著地非竞争性抑制3 nmol/L UL36的酶活性(P<0.01)。b-AP15对CEF的安全浓度小于1μmol/L,0.25,0.50μmol/L的b-AP15可以显著抑制MDV在CEF上的CPE形成以及在CEF细胞内的复制(P<0.01)。以2,5 mg/(kg·d)b-AP15对MDV攻毒雏鸡通过腹腔给药治疗,可显著抑制MDV在鸡T细胞内的复制(P<0.01)。这些结果说明,去泛素化酶抑制剂b-AP15可抑制MDV在鸡细胞内的复制。
- 于翀王文婧谢知航周正轩王婷范青松王梦涵吕岩许家翠艾永兴
- 关键词：马立克氏病病毒
- 鸡SUMO1的HIS/GST双融合纯化标签载体的构建及表达分析被引量：2
- 2015年
- SUMO(small ubiquitin-related modifier,小泛素样相关修饰物)是一种重要的蛋白翻译后修饰物,对调节蛋白质的活性、功能和细胞定位都起着至关重要的作用。虽然SUMO和泛素的空间结构很相似,但是发挥的功能却有很大的不同,SUMO不像泛素那样介导蛋白质的降解,反而可以增强蛋白质的稳定性。近年来,研究发现人的SUMO作为一种融合标签和分子伴侣来可以显著增加一些难溶解蛋白的可溶性表达。本研究以原核表达载体pET-28a为基础构建了鸡SUMO1重组质粒HIS-SUMO1-GST-pET28a,并在SUMO1和GST之间插入IL2得到重组质粒HIS-SUMO1-IL2-GST-pET28a,经IPTG诱导表达,并分别使用Ni-NTA及Glutathione-sepharose 2次亲和层析纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。活性分析发现去SUMO化酶人的SENP1可完全切开纯化融合的蛋白经。结果表明,此SUMO融合的HIS/GST双标签表达载体不但可以用于提高难溶蛋白的溶解度,而且表达产物也作为去SUMO化酶研究的底物。
- 于佩峰郑海南邓晨张鑫吴山力王梦云吕岩艾永兴
- 关键词：原核表达蛋白纯化融合蛋白
- 鸡马立克氏病毒UL36^(USP)的pTYB1表达载体的构建及表达分析
- 2016年
- UL36USP是马立克氏病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段(UL36USP),为获取无冗余氨基酸残基的纯净UL36USP蛋白。试验采用p TYB1表达载体与目的基因UL36USP构建重组表达质粒,并诱导融合蛋白表达,在含有还原剂DTT的缓冲液中利用Intein发挥内含肽的剪切活性,将UL36USP从融合蛋白上分离出来,实现目的蛋白UL36USP的单柱纯化,纯化后的蛋白不带有冗余的氨基酸残基,并利用UL36和Intein的特异性抗体进行了Western Blot鉴定。该研究尝试了一种能有利于难表达蛋白的可溶性表达的方法,并利用Intein标签的剪切活性分离产生纯净的目的蛋白,如一些难表达的病毒蛋白,为抗病毒和抗肿瘤疫苗的研究提供材料。
- 金雯王梦云余致君郑海南邓晨艾永兴
- 关键词：P病毒蛋白
- Intein融合表达鸡IL-2蛋白的多克隆抗体制备被引量：4
- 2015年
- 鸡白介素-2(chIL-2)是一种对T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞复制与分化起重要作用的细胞因子,并在机体天然免疫和获得性免疫的发生与维持中发挥重要作用。本研究中,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366bp)克隆连接到pTYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362bp的Intein基因融合在同一开放阅读框内,编码相对分子质量约为71 000的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-intein融合蛋白,应用chitin-sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western blot分析抗体特异性。结果,应用纯化的chIL-2-intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。
- 邓晨郑海南于佩峰张鑫吴山力王梦云吕岩艾永兴
- 关键词：INTEINCHICKENIL-2多克隆抗体
- 应用Intein融合的鸡IL-2蛋白制备多克隆抗体被引量：3
- 2015年
- 研究Intein标签与目的蛋白chIL-2融合作为抗原,进行高效价兔抗chIL-2蛋白多克隆抗体的制备,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366 bp)克隆连接到p TYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362 bp的Intein基因融合在同1开放阅读框内,编码分子量约为71 ku的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-Intein融合蛋白,应用Chitin-Sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western Blot分析抗体特异性。结果表明:应用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。
- 邓晨于佩峰张鑫王梦云吕岩艾永兴
- 关键词：内肽酶多克隆抗体
- 马立克氏肿瘤的泛素化组分析及CDK1泛素化的鉴定
- 马立克氏病(MD)是由血清1型马立克氏病毒(MDV-1)引起的鸡淋巴组织增生性传染病。鸡CD4T细胞最易被MDV感染转化,可经浸润在外周神经和内脏器官中形成T淋巴瘤并引起免疫抑制。MDV编码的基因参与MD肿瘤发生、MDV...
- 周小露
- 关键词：马立克氏病毒T淋巴细胞质谱CDK1
- 文献传递
- 去泛素化酶UL36USP抑制剂的筛选及其对MDV复制的抑制作用
- 鸡的马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由致病型马立克氏病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起的淋巴细胞组织增生性传染病,具有高传染性和高致病性,可造成养禽业严重的经济损失。MDV...
- 王梦涵
- 关键词：抑制剂马立克氏病毒
- 文献传递
- 马立克氏病毒UL36蛋白的表达及其去泛素化酶活性分析被引量：1
- 2017年
- 选取马立克氏病毒(MDV)去泛素化酶UL36蛋白N端具有蛋白酶活性的一段氨基酸序列,表达纯化并分析UL36的去泛素化酶活性特点。利用p Cold TF为表达载体,并在UL36-323的C端连接Strep tagⅡ作为纯化标签,构建重组质粒p Cold TF-UL36-Strep。应用大肠杆菌表达体系,低温诱导表达,并对该段蛋白进行纯化,得到可溶且纯度较高的蛋白后,通过Western blot确定所纯化的蛋白即是UL36蛋白。应用Di-Ub(K48)和SUMO1-GST作为底物鉴定其去泛素化酶活性。最终得到了可溶且纯度较高的UL36-323-Strep蛋白,并且通过酶切反应确定了其去泛素化酶活性,为进一步探究UL36在MDV感染及复制中的作用奠定前期基础,也为探究MDV的致病机理提供了必要的前提条件。
- 王梦云周宏达韦美甜吕岩吴山力艾永兴
- 关键词：MDV蛋白纯化
