教育部科学技术研究重点项目(01109)
- 作品数：5 被引量：20H指数：3
- 相关作者：王莎莉王亚平李芳菲刘永刚陈地龙更多>>
- 相关机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：教育部科学技术研究重点项目重庆医科大学科研启动基金重庆市科委基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较被引量：7
- 2006年
- 目的：比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞（hELF）作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞（EG）生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化．方法：分离、培养3—4mohELF，观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化，以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞，计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）和抗阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA-4）．结果：经丝裂霉素c处理后hELF较STO细胞生存时间明显长，形态维持更好；以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞，集落形成率没有明显差异；两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异．结论：在培养人EG细胞时，hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势．
- 刘永刚李芳菲陈地龙王莎莉王亚平
- 关键词：胚胎生殖细胞
- 人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染被引量：3
- 2007年
- 目的:构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pcDNA3.1/lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中,形成重组表达载体pEGFP-Nl/lif,并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT-PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP-LIF.结论重组pEGFP-N1/lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白,为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.
- 林雪梅李芳菲姜蓉王莎莉王亚平
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白人胚肺成纤维细胞
- 以转染白血病抑制因子基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞被引量：1
- 2007年
- 目的以转染白血病抑制因子(LIF)基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞,为建立无动物成分污染的人胚胎生殖细胞培养体系奠定基础。方法将LIF真核表达载体pcDNA3.1(+)-LIF转染到人胚肺成纤维细胞中,通过筛选和鉴定获得表达LIF的阳性细胞。将原始生殖细胞(PGCs)种植到转染后细胞制备而成的饲养层上,在不添加外源性LIF的条件下培养,并对PGCs来源的细胞集落进行鉴定。结果经RT-PCR及Western blotting鉴定证实,转染pcDNA3.1(+)-LIF的人胚肺成纤维细胞表达LIF基因。在转染后人胚肺成纤维细胞上生长的PGCs可形成典型的鸟巢状集落,经检测集落碱性磷酸酶活性呈强阳性,表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,及未分化标志Oct-4。结论用转染LIF基因后的人胚肺成纤维细胞作为饲养层能支持PGCs来源人胚胎生殖细胞的生长,维持自我更新。
- 李芳菲刘永刚王建伟王莎莉王亚平
- 关键词：人胚肺成纤维细胞白血病抑制因子饲养层逆转录聚合酶链反应免疫印迹法人胚胎生殖细胞
- 人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长被引量：6
- 2005年
- 目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件。方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6～11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA1和SSEA4;钙钴法检测碱性磷酸酶活性;RT PCR检测转录因子Oct4的表达。结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代。集落未分化标志检测显示SSEA1、SSEA4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct4表达阳性。结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。
- 刘永刚韩兵陈地龙李芳菲王亚平王莎莉
- 关键词：胚胎生殖细胞胚胎成纤维细胞免疫细胞化学人胚
- 人原始生殖细胞的迁移及表面标志物变化的实验研究被引量：4
- 2005年
- 目的 探讨人胚胎原始生殖细胞向生殖嵴迁移及其细胞标志物改变。方法 人胚生殖嵴或生殖腺经石蜡切片;HE染色,光镜观察;免疫组化方法检测阶段特异性胚胎抗原SSEA 4和SSEA 1的表达;钙 钴法检测碱性磷酸酶(AP)活性;RT PCR检测4 5、7、9、11周人胚胎生殖嵴中转录因子Oct 4的表达。结果 人胚胎第4.5周生殖嵴未见有碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA 4、SSEA 1阳性细胞,且不表达转录因子Oct 4;第5～11周胚胎生殖嵴中持续存在碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA 4、SSEA 1阳性细胞,且表达转录因子Oct 4;第12周胚胎生殖嵴中阶段特异性胚胎抗原SSEA 4、SSEA 1阳性细胞数量明显减少,但存在碱性磷酸酶阳性细胞。结论 人胚胎原始生殖细胞自第5周后开始迁移至生殖嵴,直至第11周后完全分化,其形态学特征为碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA 4、SSEA 1阳性,且表达转录因子Oct 4。
- 刘永刚陈地龙李芳菲王莎莉王亚平
- 关键词：原始生殖细胞
