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Protective Effects of Overexpression TCR Vβ5.2-HSP70 and TCR Vβ8.2-HSP70 against Collagen-Induced Arthritis in Rats被引量：2: 2007年; Collagen-induced arthritis(CIA)is an animal model,which closely resembles human rheumatoid arthritis(RA)in pathogenesis and pathology.Evidence suggests that the inhibition of T lymphocytes or their functions can alleviate the progression of arthritis.So the administration of arthritogenic T cell receptor(TCR)variable region peptide or DNA vaccines encoding pathogenic TCR Vβvariable region may provide useful information for designing specific immunotherapies against autoimmune diseases.Heat shock proteins(HSPs)have the function of raising antigenic immunogenicity and HSP70 has a protective effect against arthritis.We previously demonstrated the presence of pathogenic predominant T cell receptor Vβ5.2 and Vβ8.2 clonotypes in the joints of CIA rats.In this study,we constructed the recombinant eukaryotic expression vectors pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70,and evaluated their protective effects on CIA rats.Protective effects were observed in CIA rats by injecting these recombinant DNA vaccines,which could alleviate arthritis index,decrease the levels of IFN-γand anti-CII antibody in serum,and increase the levels of IL-4.Pathological changes were not as serious as those observed in control CIA rats.The rat injected with two combined vaccines showed better protective effects than CIA rats administered with individual vaccine.These results showed that recombinant DNA vaccines pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70 and pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70 could significantly alleviate the arthritic symptoms of CIA rats,and better protective effects could be achieved if these two vaccines were used in combination.; Jing XiaoShentao LiWei WangYun LiWenming Zhao; 关键词：DNA疫苗 HSP70

大鼠T细胞受体Vβ5.2-HSP70和Vβ8.2-HSP70基因真核表达质粒的构建及表达被引量：1: 2007年; 目的:构建含大鼠TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达。方法:实验于2005-10/2006-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。①以自主构建的重组表达载体pTARGET-TCR Vβ5.2和pTARGET-TCR Vβ8.2为模板,将结核杆菌HSP70的一段保守序列P111-125设计到引物中,通过PCR的方法得到TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因片段,将其插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70。②将BALB/c小鼠48只随机分为4组,pTARGET-TCR Vβ 5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组和空质粒组肌注相应的质粒DNA100μg/次,PBS组注射PBS缓冲液100μL/次。共注射3次,每次间隔2周。于末次免疫后3d取注射部位的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因在注射部位的转录和表达。③将COS-7细胞分为pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组、空质粒组和未转染细胞组,进行相应质粒转染,24h后收集细胞,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果:①TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因已被正确插入到pTARGET载体中。②pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组小鼠免疫处的肌肉组织RT-PCR检测显示,在500～600bp和400～500bp处出现特异的扩增带,分别与TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因片段的大小相符,而注射空质粒组和PBS组均未见此条带。③免疫组化结果显示转染重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70的COS-7细胞的胞质及胞膜都有明显的着染。结论:成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70,并在体内外检测到其转录和表达,为进一步进行TCR DNA疫苗治疗胶原诱导性关节炎的实验研究奠定了基础。; 肖婧赵文明李蕴王炜李慎涛赖丽仁; 关键词：胶原诱导性关节炎自身反应性T细胞 T细胞受体VΒ基因

大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达被引量：4: 2006年; 目的:构建含大鼠TCRVβ8.2基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达。方法:以RTPCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCRVβ8.2基因片段,插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGETTCRVβ8.2,并转化E.coliJM109,经蓝白斑筛选阳性菌落,进行菌落PCR和测序鉴定。将重组质粒以肌注法免疫BALB/c小鼠,采集注射部位股四头肌处的肌肉,用RTPCR及免疫组化染色法检测TCRVβ8.2基因在注射部位的转录和表达。通过脂质体介导,将重组质粒导入COS7细胞中进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果:测序鉴定证实,TCRVβ8.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到在肌肉组织和COS7细胞内重组蛋白的表达。结论:成功地构建重组真核表达质粒pTARGETTCRVβ8.2,并在体内体外均可检测到其转录和表达,为进一步进行TCRVβDNA疫苗的研究奠定了基础。; 李蕴马丽平赵文明刘振龙; 关键词：胶原诱导性关节炎自身反应性T细胞 TCR VΒ基因

T细胞受体DNA疫苗对胶原诱导性关节炎大鼠保护性作用的研究被引量：2: 2007年; 目的纯化制备含有编码T细胞受体（TCR）Vβ5．2和TCRVβ8．2基因片段的DNA疫苗，研究其对胶原诱导性关节炎（CIA）的保护性作用。方法大量纯化制备重组DNA疫苗pTargeT—TCR Vβ5．2、pTargeT-TCR Vβ8．2和空质粒pTargeT，观察重组DNA疫苗对CIA的保护效果，包括关节炎指数评分、大鼠后肢足关节的病理学分析、用Eli—spot法观察脾细胞分泌的干扰素（IFN）-γ和白细胞介素（IL）-4水平的改变、用流式细胞术分析外周血CD4^＋t细胞和CD8^＋T细胞亚群及其比值的变化、用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中抗Ⅱ型胶原（CⅡ）抗体水平的改变等。用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学染色法检测目的基因的转录和表达。结果重组TCRDNA疫苗pTargeT-TCRv135．2和pTargeT—TCRV138．2对CIA大鼠有较好的保护性作用，关节炎指数明显下降（P〈．05），炎性细胞因子IFN-γ水平（P〈0．05）、CD4^＋／CD8^＋比值（P〈0．05）和抗CⅡ抗体水平（P〈0．01）降低，而抑制性细胞因子IL-4水平升高（P〈0．05），病理改变亦较CIA对照组轻。且两种重组质粒联合治疗较单种重组质粒的效果更好。并且在注射部位的肌肉组织内检测到重组蛋白的转录和表达。结论重组表达载体pTargeT-TCR V β5．2和pTargeT-TCR Vβ8．2能明显减轻CIA大鼠的关节炎症状和体征，且二者联合应用效果更佳。; 葛平玲李蕴赵文明刘振龙肖婧何文晓

胶原诱导性关节炎的评定与T细胞受体-热休克蛋白70 DNA疫苗的保护作用被引量：3: 2007年; 目的:纯化制备含有编码T细胞受体(TCR)Vβ5.2/8.2基因片段与结核杆菌热休克蛋白(HSP)70的一段保守序列P111-125的嵌合DNA疫苗,观察其对胶原诱导性关节炎的保护性作用。方法:实验于2006-07/2007-02在首都医科大学免疫学系实验室完成。①实验分组:36只Lewis大鼠随机分为6组,即正常对照组、胶原诱导性关节炎对照组、空质粒组、pTARGET-TCRVβ5.2-HSP70重组质粒治疗组、pTARGET-TCRVβ8.2-HSP70重组质粒治疗组及pTARGET-TCRVβ5.2-HSP70和pTARGET-TCRVβ8.2-HSP70重组质粒联合治疗组,每组6只。②实验方法:大量纯化制备重组DNA疫苗pTARGET-TCRVβ5.2-HSP70、pTARGET-TCRVβ8.2-HSP70和空质粒pTARGET,观察重组DNA疫苗对胶原诱导性关节炎的保护效果,包括关节炎指数评分、Eli-spot法测定脾细胞分泌的干扰素γ和白细胞介素4的水平、ELISA法测定血清中抗Ⅱ型胶原抗体的水平;光镜下观察大鼠后肢足关节的病理学变化。结果:36只Lewis大鼠均进入结果分析。重组DNA疫苗pTARGET-TCRVβ5.2-HSP70和pTARGET-TCRVβ8.2-HSP70对胶原诱导性关节炎有较好的保护性作用,与胶原诱导性关节炎对照组相比,关节炎指数(P<0.05)下降,炎性细胞因子干扰素γ水平(P<0.05)和抗Ⅱ型胶原抗体水平(P<0.01)降低,抑制性细胞因子白细胞介素4水平(P<0.05)升高,病理学改变较轻。且两种重组质粒联合治疗的效果要比单种质粒好。结论:重组DNA疫苗pTARGET-TCRVβ5.2-HSP70和pTARGET-TCRVβ8.2-HSP70能明显减轻胶原诱导性关节炎大鼠的关节炎症状和病理改变,二者联合应用效果更佳。; 肖婧王炜栗占国葛平玲何文晓王立宇赵文明; 关键词：T细胞受体热休克蛋白70 DNA疫苗胶原诱导性关节炎

Original article Inhibition of collagen-induced arthritis by DNA vaccines encoding TCR Vβ5.2 and TCR Vβ8.2: 2009年; GE Ping-lingMA Li-pingWANG WeiLI YunZHAO Wen-ming; 关键词：胶原性关节炎 PTCR LEWIS大鼠血清抗体检测

结核杆菌热休克蛋白肽段对胶原诱导性关节炎保护作用的研究被引量：7: 2006年; 目的:研究结核杆菌HSP65肽段(P256-270)和结核杆菌HSP70肽段(P111-125)对类风湿关节炎动物模型——胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的保护性作用。方法:结核杆菌HSP肽段滴鼻免疫大鼠,观察其对CIA的防治效果,观察指标包括关节炎指数评分、关节病理学分析、酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测脾脏淋巴细胞分泌细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平、流式细胞术分析外周血T淋巴细胞亚群及酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清中抗CⅡ抗体水平。结果:分别经结核杆菌HSP65和HSP70肽段滴鼻免疫的实验组大鼠,与阳性对照组比较,关节炎指数明显下降(P<0·05),病理变化减轻,抑制性细胞因子IL-4水平升高(分别为P<0·05和P<0·01),而炎性细胞因子IFN-γ水平降低(P<0·01),CD4+/CD8+T细胞比值降低(P<0·05),血清中抗CⅡ抗体水平也降低(分别为P<0·05和P<0·01)。结论:应用结核杆菌HSP65肽段或HSP70肽段能减轻CIA大鼠的症状和体征,其作用机制与调节T细胞的功能有关,此研究可为探讨人类RA新的免疫治疗方法提供依据。; 何文晓李蕴赵文明刘振龙葛平玲肖婧姜涛; 关键词：HSP65 HSP70 保守序列胶原诱导性关节炎

pTARGET-TCR Vβ5.2真核表达质粒的构建及表达被引量：4: 2007年; 目的构建含大鼠TCR Vβ5.2基因的重组真核表达质粒。方法以RT-PCR法扩增Lewis大鼠脾脏淋巴细胞的TCR Vβ5.2基因片段,将目的基因直接克隆到真核表达载体pTARGET中,构建重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2。连接产物转化E.coliJM109细胞后进行蓝白斑筛选,并经菌落PCR和DNA测序进行鉴定。将重组质粒以肌注法免疫Balb/c小鼠,用RT-PCR和免疫组化方法分别检测重组质粒在注射部位的转录和表达。通过脂质体介导,将重组质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测目的基因在真核细胞内的表达。结果测序鉴定证实,TCR Vβ5.2基因已被正确插入到pTAR-GET载体中,并检测到肌肉组织和COS-7细胞内目的蛋白的表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2,为进行TCR VβDNA疫苗对胶原诱导性关节炎大鼠保护作用的研究提供了基础。; 马丽平李蕴赵文明刘振龙; 关键词：T细胞受体真核表达载体胶原诱导性关节炎

胶原诱导的关节炎大鼠关节中浸润的T细胞TCR Vβ克隆型分析被引量：9: 2005年; 目的:研究胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠关节中局部浸润的T细胞TCRVβ克隆型。方法:用II型胶原(CII)诱导Lewis大鼠发生关节炎后,经流式细胞术分析大鼠外周血CD4+和CD8+细胞的变化。提取CIA大鼠关节组织的总RNA,通过RT-PCR/SSCP方法分析大鼠两后肢足关节中TCRVβ克隆型的一致率。将CIA大鼠脾淋巴细胞转移至同系正常大鼠,观察发病情况。结果:从注射CII的第30天起,大鼠后爪出现红、肿等症状。流式细胞术分析显示,与正常大鼠相比较,CIA大鼠外周血CD8+T细胞的降低有显著性意义(P<0.01),CD4+T/CD8+T的比值大于2(P<0.01),提示CIA大鼠体内存在T淋巴细胞亚群的比例失调。CIA大鼠两后肢足关节中聚集的TCRVβ克隆型的一致率,以TCRVβ5.2和8.2最高,分别为78.89%和72.23%。脾淋巴细胞转移试验显示,受者发病的大鼠关节中,出现与供者CIA大鼠一致的TCRVβ克隆型条带,表明关节局部聚集的TCRVβ克隆型与关节炎(RA)的发病有关。结论:CIA大鼠关节局部存在以TCRVβ5.2和8.2为主的致病性的T细胞TCRVβ克隆型,可将其作为治疗CIA的靶物质,进行实验动物RA治疗的研究。; 张新梅赵文明李蕴刘振龙; 关键词：胶原诱导性关节炎 T细胞 TCR

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北京市自然科学基金(7052011)

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