国家自然科学基金(81260024)
- 作品数：8 被引量：26H指数：4
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- Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建
- 2015年
- 目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒;设计4对N1ICD-sh RNA寡核苷酸序列,以构建GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒,将p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA共转293T细胞,检测Flag的表达,筛选理想的GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒。将p GC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-sh RNA与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞,以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA,分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-sh RNA分别感染H9c2心肌细胞,利用CCK-8检测细胞活力。结果 p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功,与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞后,取上清浓缩,分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力,LV-N1ICDsh RNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA包装成功,具有Notch1信号通路生物学功能。
- 周学亮刘季春
- 关键词：NOTCH信号通路慢病毒质粒构建
- Activated Notch1 reduces myocardial ischemia reperfusion injury in vitro during ischemic postconditioning by crosstalk with the RISK signaling pathway被引量：10
- 2013年
- ZHOU Xue-liang WAN Li LIU Ji-chun
- 关键词：心肌细胞凋亡WESTERN印迹法
- Notch信号通路与心脏发育、先天性心脏病及心肌再生被引量：7
- 2012年
- Notch信号通路在细胞决定、发育、分化、增殖、凋亡、粘附及上皮-间质细胞转化过程中发挥重要作用,并参与了心脏发育的关键过程,也与心肌再生修复密切相关,Notch位点突变可引起一系列心脏畸形。本综述将集中讨论Notch信号通路及其在心脏发育、先天性心脏病和心肌再生中的作用。
- 周学亮刘季春
- 关键词：先天性心脏病NOTCH信号通路心脏发育
- Notch1减轻心肌缺血再灌注损伤作用的研究被引量：4
- 2016年
- 目的探讨Notch1减轻心肌缺血再灌注损伤作用的分子机制。方法采用Noteh1胞内结构域（NIICD）慢病毒表达载体（Lv—N1ICD）及N1ICD慢病毒干扰载体（Lv—N1ICD—shRNA）分别感染H9e2心肌细胞，建立体外心肌缺血再灌注（H／R）、缺血预适应（IPC）及缺血后适应（IPost）模型，从而分为对照组、缺氧／复氧（H／R）组、缺氧／复氧＋N1ICD感染（H／R＋N1ICD）组、缺血预适应（IPC）组、缺血预适应＋NIICD干扰（IPC＋N1ICD—shltNA）组、缺血后适应（IPost）组、缺血后适应＋N1ICD干扰（IPost＋N1ICD-shRNA）组。采用凋亡检测试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒分别检测细胞凋亡、细胞内ROS；采用免疫印迹法（Western blot）检测磷酸化糖原合成酶激酶-3β／糖原合成酶激酶-3β（p-GSK-3β／GSK-3B）的表达。结果心肌细胞凋亡率在对照组、H／R组、H／R＋N1ICD组、IPC组、IPC＋N1ICD—shRNA组、IPost组、IPost＋N1ICD—shRNA组分别为（5．34±1．70）％、（47．03±4．10）％、（33．89±12．25）％、（35．85±3．17）％、（51．12±8．22）％、（37．35±3．82）％、（47．90±3．08）％，差异有统计学意义（F=18．47，P〈0．05）。心肌细胞ROS在对照组、H／R组、H／R＋N1ICD组、IPC组、IPC＋N1ICD—shRNA组、IPost组、IPost＋N1ICD—shRNA组分别为624．66±79．52、1221．87±63．66、913．12±115．82、935．85±201．62、1204．03±113．82、967．15±106．11、1296．59±222．38，差异有统计学意义（F：8．77，P〈0．05）；心肌细胞p-GSK-3β／GSK-3β比值在对照组、H／R组、H／R＋N1ICD组、IPC组、IPC＋N1ICD—shRNA组、IPost组、IPost＋N1ICD-shRNA组分别为0．58±0．12、0．62±0．20、1．24±0．09、1．16±0．12、0．72±0．15、1．16±0．12、0．75±0．12，差异有统计学意义（F=11．21，P〈0．05）。结论Notchl作为内源性心肌保护因子，通过促进GSK-3磷酸化，抑制心肌�
- 周学亮方义湖赵勇邹斌许起荣徐华饶长秀刘季春
- 关键词：受体NOTCH1心肌缺血再灌注损伤线粒体
- 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建被引量：1
- 2017年
- 目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系。方法以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α。酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应。PCR和基因测序鉴定重组质粒。重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞。包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系。荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果。结果PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功。成功包装获得高滴度LV-HIF1α。LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组。结论慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功。
- 邹斌周学亮詹宇亮陈紫晴赖松青吴霞刘季春
- 关键词：HIF1Α慢病毒载体A549
- Notch1胞内结构域真核表达质粒构建及在H9c2心肌样细胞的表达和生物学功能被引量：1
- 2013年
- 目的构建Notch l胞内结构域(N1ICD)真核表达质粒,确定能在H9c2心肌样细胞内表达,并发挥生物学效应,为后续Notch1信号通路的研究提供实验依据。方法设计并合成1对含有BamH I和EcoR I酶切位点的特异性引物,以小鼠cDNA文库为模板,经PCR扩增得到了1 122 bp的目的片段,定向克隆至pcDNA 3.1/myc-His质粒,构建pcDNA3.1/N1ICD-myc-His真核表达质粒。通过双酶切及基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,48 h后提总蛋白,Western-blotting检测myc和Hes1,确定N1ICD能在H9c2细胞表达,并启动下游基因表达。结果表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His双酶切及基因测序正确,N1ICD可在H9c2心肌样细胞内高效表达,具有Notch1生物学效应。结论真核表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His构建成功,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础。
- 周学亮万力刘季春
- 关键词：NOTCH信号通路质粒构建
- Notch信号通路相关分子在肺癌中的表达、临床意义及生物学作用被引量：4
- 2017年
- 最新数据显示，我国男性肺癌的发生率及病死率每年均高居榜首（2000-2011年），女性肺癌发生率居第2位，病死率居首位；据估计，2015年我国肺癌的新发病例和死亡人数将分别达到733000和610000。肺癌主要包括非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC；约占80％）和小细胞肺癌（smallcelllungcancer，SCLC；约占20％）。
- 邹斌周学亮刘季春
- 关键词：肺肿瘤NOTCH信号通路增殖耐药
- Notch1 miRNA干扰质粒构建及功能鉴定
- 2013年
- 目的设计及构建大鼠Notch1微小干扰核糖核酸(miRNA)干扰质粒,最终筛选出效果最好的干扰质粒。方法针对大鼠Notch1基因分别设计3对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒,基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,Western blot检测3对干扰质粒、阴性对照质粒对Notch1胞内结构域(N1ICD)表达的影响。结果测序表明,Notch1干扰序列及读码框完全正确,荧光显微镜观察H9c2心肌样细胞miRNA瞬时转染效率在80%左右。Western blot显示miRNA6637对Notch1干扰效果最强。结论成功构建大鼠Notch1 miRNA的有效干扰质粒,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础。
- 周学亮万力刘季春
- 关键词：NOTCH信号通路干扰质粒
