黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521z004)
- 作品数：15 被引量：77H指数：6
- 相关作者：任桂萍李德山王文飞叶贤龙于引航更多>>
- 相关机构：东北农业大学中国水产科学研究院黑龙江水产研究所新乡学院更多>>
- 发文基金：黑龙江省教育厅科学技术研究项目黑龙江省博士后科研启动基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 抗IL-1βscfv抗体与TNF—α可溶性受体融合蛋白的构建及其生物学活性分析被引量：2
- 2012年
- 目的设计原核表达抗人白细胞介素．1B单链抗体（IL-1βscfv）与TNF．仪可溶性受体的融合蛋白，并分析其生物学活性，为类风湿关节炎的治疗提供新的候选药物。方法利用RT-PCR方法从HeLa细胞总RNA中扩增了人肿瘤坏死因子I型受体胞外区基因片段，与抗人IL-1βscfv通过抗体铰链区融合，克隆至pET27b（＋）表达载体中，构建成pET-IL-1scfv：TNFR1质粒；转化大肠杆菌Rosetta进行表达。从包涵体中纯化得到IL-1scfv：TNFR1蛋白，进行IL-1scfv：TNFR1的鉴定及活性检测。结果ELISA结果证明，IL-1scfv：TNFRl可以分别结合hIL-1β和hTNF-α，并呈现剂量依赖性，表明IL-1scfv：TNFR1的单链抗体部分和可溶性受体部分可以各自形成正确的空间构象；免疫斑点分析证明，IL-1scfv：TNFRl与hTNF—α结合后仍可以结合hIL-1β，具有同时结合hlL-1β和hTNF-α的两种靶分子的能力，表明IL-1scfv：TNFR1的两个部分不会相互影响与靶分子的结合。活性测定结果表明，IL-1scfv：TNFRl可以有效封闭肿瘤坏死因子对L929细胞的细胞毒效应，具有显著抑制hlL-1β促进L929细胞增殖的活性，IL-1scfv：TNFR1对两种靶分子的拮抗作用均呈现明显的剂量依赖性。结论成功构建了能够同时结合hIL-1β和hTNF-α两种靶因子的双特异性IL-1scfv：TNFR1融合蛋白，并能有效抑制hTNF-α和IL-1β的生物活性，为类风湿关节炎的治疗提供新的候选药物。
- 阚方明任桂萍郭茉韩阳齐剑英张宇张雅坤李德山
- 关键词：白细胞介素1Β肿瘤坏死因子Α类风湿关节炎
- 抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测被引量：2
- 2013年
- 目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础。方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27b-A-hIL-1β-scFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白。利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力。结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化。得到纯度为72.05%、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白。ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖。结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础。
- 李天鹤任桂萍徐黎明周兵郭茉齐剑英张宇赵景壮于引航尹杰超李德山
- 关键词：单链抗体包涵体复性中和活性MTT
- 三种双特异性抗体对小鼠类风湿关节炎模型的治疗效果
- 2014年
- 为获得治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的先导药物,本研究比较了3种双特异性抗体(BsAB-1、BsAB-2和BsAB-3)对Ⅱ型胶原(CII)诱导的RA(CIA)模型小鼠的治疗效果。首先用ELISA法比较了3种二价抗体同时与两种抗原的结合能力,结果显示,3种抗体均能同时结合两种抗原,BsAB-1结合抗原的能力优于其他两种抗体(P<0.01)。用鸡CII建立CIA模型,用纯化的抗体对CIA模型小鼠进行治疗,每2天给药1次,治疗29天。治疗结束后与CIA模型对照组相比,各治疗组小鼠踝关节肿胀、皮肤紧绷、后足皮肤表面充血等临床症状明显减轻,其中BsAB-1治疗后足趾肿胀不明显,基本恢复正常。采用ELISA法检测了各组小鼠血清中CII抗体,real-time PCR法检测了脾脏中细胞因子IL-2、IL-1β、IL-17A和TNF-α的表达水平。与CIA模型对照组相比,所有抗体治疗组都能明显降低血清中CII抗体水平、脾脏中IL-2、IL-1β、IL-17A和TNF-α的表达量,且BsAB-1治疗效果最佳,与另外两种抗体比较有显著差异(P<0.01)。因此,3种二价抗体对CIA模型小鼠都有治疗效果,BsAB-1的治疗效果要优于另外两种抗体,是优选的先导药物。
- 李清萃韩晓辉周兵王文飞任桂萍孙翠羽吴强于引航徐黎明王秋颖齐剑英魏雨泉曹宏伟韩俊岩李德山
- 关键词：双特异抗体II型胶原
- FGF-21对H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化应激损伤的保护作用被引量：11
- 2014年
- 成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growth factor-21,FGF-21)是机体内重要的代谢调节因子,但尚不清楚FGF-21对心血管系统的直接影响。本研究利用H2O2诱导的心肌细胞H9c2氧化应激模型,分别用MTT、流式细胞术、real-time PCR等方法评价FGF-21是否具有对抗氧化损伤引起的心肌细胞凋亡的能力及其相关作用机制。结果显示,FGF-21能提高H2O2处理后的H9c2细胞存活率,降低心肌细胞凋亡,并减少H2O2引起的ROS累积;而且FGF-21通过上调SOD活性以及调控Bcl-2/Bax的表达量,发挥抑制细胞凋亡的作用。研究结果证实,FGF-21能够保护心肌细胞免受氧化应激带来的损伤。
- 韩苗苗王文飞刘铭瑶李德山周兵于引航任桂萍
- 关键词：FGF-21心肌细胞过氧化氢氧化应激损伤
- 成纤维细胞生长因子21对胰岛素抵抗所致高血压的治疗作用被引量：9
- 2013年
- 本文研究考察成纤维细胞生长因子21(FGF21)对果糖诱导的胰岛素抵抗高血压模型的治疗作用及其机制。10%果糖诱导SD大鼠4周建立胰岛素抵抗高血压模型,成模后随机分为4组:模型对照组及FGF210.25、0.1和0.05μmol·kg-1·d-1剂量组,5只相同周龄的正常SD大鼠作为正常对照组。每天注射1次,治疗4周,给药期间每周监测大鼠体重,采用尾套法检测收缩压变化;口服葡萄糖耐量试验(OGTT)及胰岛素稳态评价模型检测胰岛素抵抗情况;给药结束时留取血清样本分别测定血清胰岛素、血脂、血糖水平。结果显示,治疗4周后,不同剂量FGF21治疗组大鼠收缩压均下降至正常水平[(122.2±3.5)mmHg,P<0.01],而注射生理盐水的模型对照组大鼠的收缩压在治疗期间一直维持在较高水平[(142.5±4.5)mmHg]。24 h观察各组大鼠血压发现,FGF21治疗组大鼠24 h血压基本维持在(130±4.5)mmHg,各时间段血压均显著低于模型对照组[(130±4.5)vs(143±5.5)mmHg,P<0.01]。FGF21治疗组大鼠血脂改善明显,总胆固醇与甘油三酯含量均显著下降至正常水平。FGF21各治疗组大鼠血清NO含量均显著高于模型对照组[(7.32±0.11),(7.24±0.13),(6.94±0.08)vs(6.56±0.19)μmol·L-1,P<0.01],且其改善程度呈现明显的剂量依赖性,表明FGF21可明显升高果糖诱导高血压模型大鼠血清NO含量,改善内皮释放NO功能。OGTT及HOMA-IR结果显示,经FGF21治疗4周后胰岛素抵抗亦明显得到改善,且呈现剂量依赖性。因此本研究揭示了FGF21通过改善胰岛素抵抗,显著降低SD大鼠由于胰岛素抵抗所引起的高血压。这一发现为临床应用FGF21治疗原发性高血压奠定了理论基础。
- 朱升龙任桂萍张振宇王文飞叶贤龙韩苗苗赵景壮徐彤宇刘铭瑶李德山
- 关键词：成纤维细胞生长因子21胰岛素抵抗高血压果糖
- 9R穿膜肽可增强P53抗肿瘤效果被引量：2
- 2013年
- 为解决P53蛋白难以进入细胞内部发挥治疗作用的瓶颈难题。将p53基因融合插入带有9个精氨酸作为穿膜肽的表达载体中表达融合蛋白CPPs-P53,并与没有穿膜肽的P53蛋白进行比较,利用Western blotting方法检测蛋白的表达情况,MTT及Annexin V/PI双染法检测细胞生长抑制率及细胞凋亡率。Western blotting检测表明已成功在原核表达系统中表达融合蛋白CPPs-P53和P53蛋白,且蛋白纯度均已达到90%以上;MTT检测表明,P53蛋白对肿瘤细胞的生长虽有一定的抑制作用,但融合蛋白CPPs-P53与之相比,对肿瘤细胞生长的抑制效果显著增强,细胞生长抑制率有明显的提升,并且细胞生长抑制率呈现剂量依赖性;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况也表明P53虽可以在一定程度上诱导肿瘤细胞的凋亡,但与P53蛋白相比较,融合蛋白CPPs-P53诱导的凋亡细胞明显增加,凋亡率是P53蛋白的2~3倍。由此说明在抑制肿瘤细胞的生长和诱导细胞凋亡方面,CPPs-P53比没有穿膜肽的P53蛋白的效果更显著。
- 刘源陈睿张楠叶贤龙白银魏雨泉任桂萍李德山
- 关键词：P53穿膜肽细胞凋亡
- FGF21对MSG胰岛素抵抗小鼠的非酒精性脂肪肝的治疗作用及其机制研究被引量：11
- 2013年
- 研究成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)对谷氨酸钠(MSG)肥胖小鼠非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的治疗作用及其作用机制。实验分为正常对照组、模型对照组、高剂量FGF21治疗组和低剂量FGF21治疗组。给药5周,给药期间每周监测小鼠体重,给药结束时测定血脂和血清胰岛素及转氨酶含量。Real-time PCR方法检测肝脏和脂肪组织内能量代谢调节关键基因表达。结果显示,治疗5周后,不同剂量FGF21均明显降低MSG模型体重(P<0.01),纠正其血脂紊乱(P<0.01),减轻模型小鼠的肝内脂肪变性,恢复其肝脏细胞正常形态结构,并且可显著改善MSG模型鼠胰岛素抵抗状态。因此,FGF21能显著减轻MSG肥胖小鼠体重、改善胰岛素抵抗、逆转模型小鼠的肝内脂肪变性,这一发现为临床应用FGF21治疗非酒精性脂肪肝奠定了理论基础。
- 朱升龙张振宇任桂萍叶贤龙马蕾于丹韩苗苗赵景壮张天援李德山
- 关键词：成纤维细胞生长因子21胰岛素抵抗非酒精性脂肪肝谷氨酸钠
- 犬干扰素-γ的可溶表达及其产物的活性鉴定被引量：1
- 2013年
- 为研究犬干扰素-γ(CaIFN-γ)的可溶表达,本研究应用SUMO表达系统高效稳定、可溶地表达了SUMO-CaIFN-γ蛋白。以MDCK细胞为靶细胞,MTT法检测CaIFN-γ对该细胞增殖的抑制作用。结果表明,CaIFN-γ对MDCK具有明显的抑制作用。Real time法检测CaIFN-γ刺激MDCK细胞后,细胞内源p53 mRNA水平的变化,结果显示,p53的表达量与CaIFN-γ的剂量和时间呈依赖性关系。本研究为进一步研究CaIFN-γ的生物学特性、研制新型CaIFN-γ用于我国犬类疾病的治疗及CaIFN-γ生物制剂的生产奠定了基础。
- 韩阳郝志超王琪王文飞赵景壮郭茉吴云舟叶贤龙任桂萍李德山
- 关键词：SUMOMTTP53
- 成纤维细胞生长因子21对胰岛素抵抗缓解作用机制的研究被引量：8
- 2015年
- 本文考察了成纤维细胞生长因子21(FGF21)对胰岛素抵抗小鼠模型的治疗作用及其机制。采用高热量脂肪饮食联合小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病小鼠模型,随机分成2型糖尿病组与FGF21治疗高、低剂量组及胰岛素治疗组,并与正常对照组比较。测定5组间小鼠血清葡萄糖、胰岛素、脂质产物及血清和肝脏组织炎症因子水平的变化。结果显示,2型糖尿病组血糖、胰岛素、游离脂肪酸(FFAs)、甘油三酯及炎症因子平均水平较正常对照组显著增高(P<0.01),与胰岛素组比较无显著性差异。FGF21治疗组血糖、胰岛素、血脂及炎症因子平均水平较2型糖尿病组及胰岛素组显著降低(P<0.01),与对照组无差异。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)结果显示,经FGF21治疗4周后胰岛素抵抗亦明显得到改善,且呈现剂量依赖性。因此本研究揭示了FGF21可以改善2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗水平,可能与其参与调控炎症因子水平有关。
- 徐彤宇王文飞徐鹏飞袁清艳刘双庆张童任桂萍李德山
- 关键词：成纤维细胞生长因子21胰岛素抵抗2型糖尿病炎症因子
- 提高成纤维细胞生长因子-21产率和纯度被引量：2
- 2014年
- 成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)作为近期发现的新型代谢调节因子,因其具有独立于胰岛素调节糖脂代谢、增加胰岛素敏感性等作用,有望成为治疗糖尿病的新型药物。包涵体形式表达外源蛋白表达量及纯度高,但是以pET载体表达时,FGF-21以包涵体形式表达,且复性率及产率低,蛋白活性降低[1]。针对这一瓶颈问题,用SUMO载体首次以包涵体形式表达带有SUMO标签的hFGF-21,通过优化培养条件,并应用中空纤维柱膜过滤技术对菌体进行富集,对包涵体进行洗涤、变性及复性,经过亲和层析、凝胶过滤层析的纯化方法,得到了成熟的hFGF-21,在保证蛋白活性的同时增加了蛋白的产量及纯度。通过检测HepG2细胞葡萄糖吸收及2型糖尿病db/db小鼠短期及长期血糖变化鉴定其降糖生物学活性。结果表明,以包涵体形式表达hFGF-21(ihFGF-21)的表达量是可溶形式表达的hFGF-21(shFGF-21)的3倍,最终ihFGF-21的收率为20 mg/L,而shFGF-21的收率仅为6 mg/L。ihFGF-21的纯度可达到95%以上,而shFGF-21仅能达到90%左右;在细胞水平和动物水平上两者的降糖生物学活性一致。在保证hFGF-21生物学活性的前提下,与传统包涵体途径提取目的蛋白的方法相比,应用中空纤维柱膜过滤技术使hFGF-21的生产周期缩短了约1/3左右。综上所述,此法为FGF-21中试及工业化生产提供了高效、经济的策略。
- 于丹叶贤龙任桂萍徐鹏飞厉书杰牛泽杉李德山
- 关键词：蛋白表达糖尿病
