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CREG低表达饲养层STO细胞的建立被引量：1: 2012年; 目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)自我更新的影响及作用机制,本研究拟通过RNA干扰方法建立CREG低表达的饲养层STO细胞,为深入研究奠定基础。方法:用Western Blot方法检测饲养层细胞系STO及ESC细胞系R1中CREG基因的表达。利用Lipofectamine 2000向STO细胞中分别转染RNA干扰空对照载体,含有无意义随机序列的对照载体以及含有4种不同CREG干扰序列的载体。用1.0μg/ml嘌呤霉素筛选1 w,荧光显微镜下挑取绿色荧光蛋白表达较高的克隆进行扩增。Western Blot方法鉴定CREG基因干扰效率,获得CREG表达最低的饲养层细胞克隆。将ESC R1接种到该克隆上,不添加白血病抑制因子,连续培养3代,用碱性磷酸酶染色判断其是否分化。结果:R1几乎不表达CREG,而STO细胞高表达CREG。Western Blot结果证实筛选到的STO克隆3A干扰效果最好,达到85%。在不添加白血病抑制因子的情况下,碱性磷酸酶染色表明R1细胞在该株饲养层细胞上连续培养3代后未见明显分化。结论:成功获得CREG低表达饲养层STO细胞,为深入探讨CREG对ESC自我更新的作用及机制奠定了基础。; 田孝祥张剑陶杰孙鸣宇闫承慧韩雅玲; 关键词：RNA干扰饲养层细胞胚胎干细胞自我更新

CREG基因敲除小鼠胚胎干细胞的筛选及鉴定被引量：1: 2012年; 目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在发育过程中的作用,本研究拟通过高浓度药物筛选获得基因敲除的小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)。方法:用0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml、2.5 mg/ml及3.0 mg/ml 6个浓度的G418培养CREG杂合型(CREG其中一个等位基因被新霉素抗性neo基因替代)小鼠ESC 2周,确定最佳的G418筛选浓度。挑取该浓度下存活的ESC克隆进行扩增。将每个ESC克隆一半冻存,另一半贴壁培养。待ESC生长至80%融合后分别提取基因组DNA和蛋白。PCR方法扩增CREG基因明确基因组中是否存在CREG基因,WesternBlot方法鉴定是否有CREG蛋白表达。结果:确定2.0 mg/ml G418为最佳的筛选浓度。在该浓度下,共获得存活的克隆10个,PCR证实C2及C7克隆基因组中没有CREG基因,Western Blot证实C2及C7无CREG蛋白表达。结论:成功获得CREG基因敲除的小鼠ESC 2株,为深入研究CREG功能奠定了基础。; 田孝祥张剑陶杰孙鸣宇闫承慧韩雅玲; 关键词：基因敲除胚胎干细胞

过表达CREG抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡: 2013年; 目的:探讨E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在高糖引起的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)损伤中的作用,为寻找糖尿病血管病变新的治疗靶点提供实验依据。方法:采用胶原酶消化法分离原代HUVECs,并用内皮细胞标志物CD31免疫荧光染色进行鉴定。分别用含有5.5 mmol/l葡萄糖(正常糖对照组)、5.5 mmol/l葡萄糖+27.5 mmol/l甘露醇(渗透压对照组)或33 mmol/l葡萄糖(高糖组)的培养液培养HUVECs 48 h。Western Blot检测剪切体caspase-3表达;Annexin V/PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡。通过感染表达CREG基因的腺病毒获得CREG过表达的HUVECs,Western Blot及流式细胞术评价CREG过表达对HUVECs凋亡的影响。结果:高糖处理48 h后,HUVECs内剪切体caspase-3的蛋白表达增加,细胞凋亡率增加;过表达CREG后,高糖处理的HUVECs内剪切体Caspase-3表达和凋亡细胞比例均明显降低,但仍高于正常糖对照组。结论:CREG过表达可抑制高糖引起的HUVECs凋亡。; 田孝祥陶杰张剑孙鸣宇彭程飞闫承慧韩雅玲; 关键词：高糖内皮细胞凋亡

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国家重点基础研究发展计划(2011CB512111)