国家自然科学基金(31272415C170102)
- 作品数：8 被引量：11H指数：3
- 相关作者：苏玉虹朱弘焱田玉民张尚松曾阳阳更多>>
- 相关机构：辽宁医学院南京农业大学锦州医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金辽宁省教育厅基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- MEF2C基因RNA干扰质粒的构建及干扰效率测定
- 2015年
- 为了构建猪MEF2C基因的RNA干扰重组质粒,并筛选出最佳干扰效率的序列,本试验采用RNAi技术,设计并合成了3条针对猪MEF2C基因的RNA干扰序列,构建了RNA干扰重组质粒(命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),将其转染到小鼠C2C12细胞,并用实时定量PCR检测细胞中MEF2C基因mRNA的表达,Western blot测定细胞中MEF2C基因蛋白的表达。结果表明:重组质粒经PCR扩增后显示产物大小与预期一致,产物经双酶切及测序鉴定该序列与NCBI提供的序列一致。重组质粒转染C2C12细胞后,MEF2C基因mRNA表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(33.67±2.51)%、(21.00±3.60)%、(71.67±4.04)%。Western blot结果表明MEF2C基因蛋白表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(47.33±0.05)%、(38.25±0.16)%、(67.27±0.12)%。本试验成功构建猪MEF2C基因干扰重组质粒,最终确定干扰质粒(siRNA-3)具有最佳干扰效果,证实MEF2C基因的干扰质粒能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为探讨该基因与肌肉肉质性状的关系提供理论基础。
- 曾阳阳朱弘焱田玉民苏玉虹
- 关键词：C2C12重组质粒转染
- 猪CFL2基因荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析
- 2013年
- 为了进一步深入研究猪CFL2基因转录调控机制,通过PCR方法,从猪基因组DNA中获得CFL2基因起始密码子上游12段逐步缺失的CFL2启动子序列,分别定向克隆至含有荧光素酶报告基因的pGL4.10载体上。构建了12种荧光素酶报告基因载体:pGL4.10-222、pGL4.10-383、pGL4.10-482、pGL4.10-666、pGL4.10-912、pGL4.10-1021、pGL4.10-1093、pGL4.10-1305、pGL4.10-1369、pGL4.10-1554、pGL4.10-1680、pGL4.10-1826。以pGL4.74为内参质粒,分别瞬时转染小鼠成肌细胞C2C12、小鼠成纤维细胞NIH3T3、人宫颈癌细胞HeLa,48 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果表明:pGL4.10-1554(-1 502^+51 bp)的转录活性最强,初步证实-1 502^-1 317 bp区域为CFL2启动子的活性区域,从而为进一步研究CFL2的转录调控奠定了基础。
- 王佳美郎斌朱弘焱苏玉虹
- 关键词：启动子
- 猪MEF2C基因慢病毒表达载体构建及C2C12细胞转染条件的优化被引量：2
- 2014年
- MEF2C基因能够控制肌细胞分化过程中的基因转录,特别在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。本研究将猪MEF2C基因化学合成后经Bam HI和Asc I双酶切后克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP中,获得的重组质粒用限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;利用慢病毒阴性对照侵染靶细胞C2C12来确定最佳MOI值以及靶细胞最适抗生素Blasticidin剂量。结果显示猪MEF2C基因成功克隆到慢病毒表达载体中;该重组质粒侵染靶细胞C2C12的最佳MOI值为300;靶细胞抗生素的筛选剂量为4μg/mL,维持剂量为3μg/mL上述试验为建立MEF2C稳定过表达细胞系提供了前期工作基础。
- 朱弘焱杨卉新田玉民苏玉虹
- 关键词：慢病毒表达载体C2C12细胞
- 稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞株构建及鉴定被引量：2
- 2015年
- 为了获得稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞C2C12细胞株,将猪skMLCK基因cDNA序列T-A克隆至pMD-18T载体;重组质粒经双酶切后,定向克隆至真核表达载体,获得表达重组质粒pEGFP-N1-skMLCK;经脂质体介导,重组质粒稳定转染入C2C12细胞中;通过实时定量PCR方法检测skMLCK基因的表达水平,以及其他相关基因的表达情况。结果:获得了稳定表达猪skMLCK基因的C2C12细胞株;连续培养30d后,用实时定量PCR方法检测到skMLCK基因高表达,同时发现CFL2b和MEF2C基因表达下调。试验表明稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞系构建成功,为猪skMLCK基因功能的进一步研究提供了前期工作基础。
- 丛玲田玉民张尚松朱弘焱苏玉虹
- 丝切蛋白CFL2基因低表达对小鼠成肌细胞C2C12肌纤维信号通路关键成分的影响
- 2017年
- 探讨低表达丝切蛋白CFL2基因对小鼠成肌细胞C2C12信号通路关键成分的影响。采用RNAi技术,将猪CFL2基因真核表达shRNA重组体稳定转染至小鼠成肌细胞C2C12后提取其总RNA和总蛋白质,采用Real-time PCR和Western blot检测CFL2基因低表达后成肌细胞C2C12信号通路关键成分(MEF2C、sk MLCK、Rho A、AMPKα2、p38和Ca M)的表达情况。结果表明:在3个稳转细胞株中MEF2C、Ca M、p38和AMPKα2的mRNA表达均为极显著下调(P<0.01),sk MLCK的mRNA表达为极显著上调(P<0.01),其它成分不显著;MEF2C和Ca M的蛋白表达在3个稳转细胞株中均为显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01),其他4种成分(p38、Rho A、AMPKα2和sk MLCK)均差异不显著(P>0.05),说明CFL2低表达显著下调信号通路关键成分MEF2C和Ca M的表达,CFL2与Ca M和sk MLCK分别呈显著正相关和负相关。
- 韩佳琪苏玉虹解放田玉民朱弘焱
- 关键词：丝切蛋白低表达C2C12细胞肌纤维信号通路
- 猪skMLCK基因全长cDNA测序及真核表达载体构建被引量：4
- 2014年
- 为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。
- 张尚松苏玉虹巴彩凤
- 关键词：猪肉品质CDNA真核表达载体
- 猪CFL2基因启动子的克隆与序列分析被引量：3
- 2013年
- CFL是真核生物肌动蛋白结合蛋白家族的成员。CFL2主要在哺乳动物的骨骼肌和心肌表达,在肌肉纤维的形成过程及肌肉的再生起重要作用。为了深入研究猪CFL2基因转录的调控机制,本研究利用染色体步移法首次获得了CFL2基因起始密码子上游约2.5 kb区域的序列。应用相关生物信息学软件对该序列进行分析,预测了其启动子核心区域及转录起始点,发现在起始密码子上游-508 bp和-453 bp两处存在TATA-box,另外还发现了GC-box、CAAT-box;该序列还包含SP1、AP1、AP2、GATA-1等转录因子结合位点。本试验结果为进一步研究该基因表达调控与肌肉发育的关系奠定了基础。
- 王佳美赵微郎斌朱弘焱苏玉虹
- 关键词：染色体步移启动子
- 猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定被引量：3
- 2016年
- 为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。
- 曾阳阳朱弘焱田玉民苏玉虹
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体转染
