江苏省高校自然科学研究项目(07KJB320076)
- 作品数：4 被引量：4H指数：2
- 相关作者：徐艳李璐王晓茜杨迷芳段君兰更多>>
- 相关机构：南京医科大学南京医科大学附属口腔医院更多>>
- 发文基金：江苏省高校自然科学研究项目国家自然科学基金教育部留学回国人员科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 伴放线放线杆菌cdtB基因克隆及其表达蛋白的体外生物学活性检测被引量：4
- 2010年
- 目的 体外构建伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa）CdtB蛋白的原核表达载体并诱导其表达,通过变性、复性获得有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ）样活性的重组CdtB蛋白,为进一步研究AaCdtB的功能以及Aa细胞致死性扩张毒素三聚体全毒素在牙周炎发生、发展过程中的分子致病机制奠定基础.方法 以AaATCC29522基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应（PCR）法获得cdtB基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体pET-15b-cdtB.转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导CdtB蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）及蛋白质印迹法检测并鉴定蛋白表达.纯化的重组CdtB体外与超螺旋质粒（pET-32a）DNA孵育,观察其生物学活性.结果 经测序鉴定,构建的原核表达载体pET-15b-cdtB转染的感受态大肠杆菌携带有cdtB基因,该基因片段与GenBank中已收录的AacdtB基因序列一致性高达99%.SDS-PAGE观察到32 000左右的高表达蛋白条带,蛋白质印迹法发现带有6个组氨酸蛋白标签标记的目的 蛋白CdtB.超螺旋质粒DNA与CdtB体外孵育后发生了解螺旋现象.结论 本项研究成功构建了AaCdtB的原核表达载体并诱导CdtB蛋白的体外表达,获得了具有DNaseⅠ样活性的重组CdtB蛋白.
- 李璐段君兰王晓茜杨迷芳徐艳
- 关键词：基因克隆
- 伴放线放线杆菌cdtC基因的克隆及其原核表达载体pET15b-cdtC的构建被引量：4
- 2010年
- 目的:本实验设计克隆Aa CdtC亚基蛋白的编码基因cdtC并构建其原核表达载体pET 15b-cdtC,为研究CdtC亚基对CDT全毒素功能的分子机制奠定基础。方法:厌氧培养Aa ATCC 29523,提取Aa基因组DNA,PCR反应扩增cdtC基因片段。将此片段克隆入pMD 19-T Vector,经限制性内切酶BamHI和Xho I酶切得到粘性末端cdtC片段,克隆入原核表达载体pET 15b中。结果:产物经PCR初步鉴定后进行DNA序列分析,测序结果与Genbank公布序列一致性达100%。结论:本实验成功克隆了cdtC基因,并成功构建了其原核表达载体pET15b-cdtC。为深入研究CdtC亚基以及CDT全毒素分子作用机制奠定基础。
- 王晓茜李璐徐艳
- 关键词：伴放线放线杆菌基因克隆原核表达载体
- 慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP的构建及其在NIH3T3细胞中的表达
- 2010年
- 目的:构建携带人白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP,并检测其在NIH3T3细胞中的表达。方法:采用PCR技术从含有人IL-1ra基因的质粒pEGFP-N1-IL-1ra中扩增目的基因IL-1ra,并将该基因克隆至慢病毒表达质粒pLenti,PCR及DNA测序来鉴定构建的重组质粒pLenti-IL-1ra。从质粒PMIG中切取IRES-GFP基因片段,插入鉴定正确的质粒pLenti-IL-1ra中以构建重组质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP。将构建成功的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP、包装质粒Δ8.91、包膜质粒pVSVG共转染293T细胞。获取携带IL-1ra基因的重组慢病毒Lenti-IL-1ra-IRES-GFP,并感染NIH3T3细胞,荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达。灭瘟素(Blasticidin)筛选15 d,RT-PCR检测目的基因的表达,ELISA检测目的蛋白的表达。结果:PCR及DNA测序结果均表明人IL-1ra基因与质粒pLenti正确重组;IRES-GFP基因经PCR鉴定已成功插入质粒pLenti-IL-1ra;三质粒共转染293T细胞可获得重组慢病毒。慢病毒感染NIH3T3细胞后,荧光倒置显微镜下能直接观察荧光蛋白的表达,RT-PCR和ELISA分别检测到IL-1ra在基因水平和蛋白水平的表达。结论:成功构建了携带人IL-1ra基因的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的进一步研究奠定了实验基础。
- 苏毅束为李松石小丹徐艳
- 关键词：IL-1RA牙周炎基因治疗
- 伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素的细胞毒性研究
- 2011年
- 目的:体外诱导表达伴放线放线杆菌(Aqqregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin,CDT),观察其对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa cell)的毒性作用。方法:诱导重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC的体外表达,采用镍亲和层析柱法纯化目的蛋白,体外重构Aa CDT全毒素。通过体外酶活性实验检测重组蛋白CdtB的生物学活性,并通过细胞克隆形成实验(Colony-forming experiment)及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide,MTT]比色法进一步观察CDT对CHO细胞和HeLa细胞的毒性作用。结果:由重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC体外重构获得的Aa CDT全毒素不仅抑制CHO细胞增殖,导致CHO细胞克隆形成单位(Colony-Forming Unit,CFU)数目减少甚至消失。也可抑制He-La细胞增殖并引起包括细胞体积增大及细胞核增大增多的细胞形态学改变,并且此增殖抑制作用呈浓度依赖性。结论:体外成功构建了具有生物学活性的Aa CDT全毒素,且Aa CDT毒性发挥需要三个亚基CdtA、CdtB、CdtC同时存在并构成三聚体。
- 段君兰李璐徐艳杨迷芳
- 关键词：伴放线放线杆菌中国仓鼠卵巢细胞HELA细胞
