国家高技术研究发展计划(2011AA10A203)
- 作品数：80 被引量：259H指数：8
- 相关作者：张杰束长龙夏立秋丁学知高继国更多>>
- 相关机构：中国农业科学院植物保护研究所湖南师范大学福建农林大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 苏云金芽胞杆菌Cry1Ba3蛋白定点突变对杀小菜蛾活性的影响被引量：2
- 2011年
- Cry1Ba3是由本实验室发掘的对小菜蛾有高毒力的杀虫晶体蛋白。为了寻找对杀虫活性有重要影响的氨基酸,为杀虫机理研究和改造杀虫蛋白提供理论依据,本研究利用Ple Bio-Informatique Lyonnais数据库对Cry1Ba3的二级结构进行模拟;采用BioEdit软件分析Cry1Ba3的疏水区;将Cry1Ba3与Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1以及Cry4Ba1进行多序列比对,从而确定了20个氨基酸突变位点。利用半重叠引物PCR的方法对Cry1Ba3进行定点突变,将突变体在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。通过浸叶法对各个突变蛋白杀小菜蛾的生物活性进行测定。获得的20个Cry1Ba3突变体均能在大肠杆菌BL21中表达,并以包涵体形式存在。杀虫活性测定结果表明M6(R192L)、M10(W303A)、M19(H485G)对小菜蛾的活性明显降低,二级结构预测表明活性降低的突变蛋白的构象均发生明显变化,其余17种突变蛋白的活性和二级结构都没有明显变化。说明第192位的精氨酸、第303位的色氨酸和第485位的组氨酸对Cry1Ba3的杀小菜蛾活性有重要影响,上述3个位点氨基酸突变引起的蛋白活性减低可能与毒素的空间结构变化有关。
- 林承喜束长龙翟元娜林毅宋福平张杰
- 关键词：定点突变生物活性测定小菜蛾
- 刺糖多孢菌bldD基因过表达对多杀菌素合成及其孢子形成的影响被引量：3
- 2015年
- bld D基因是链霉菌中的全局性调控基因,调节菌体的形态分化与次级代谢产物的合成。本研究采用重叠延伸PCR将bld D基因置于红霉素强启动子(Perm E)的控制下克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭载体p UC-spn上,构建重组载体p UC-spn-Perm E-bld D;通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中,获得遗传性能稳定的重组菌株S.spinosa-Bld D。平板培养观察发现,在BHI和TSB平板上,重组菌株的孢子形成受到明显抑制。摇瓶发酵结果显示,重组菌株多杀菌素产量相比对照菌株提高了1.35倍。因此,bld D基因的过量表达在一定程度上抑制刺糖多孢菌的孢子形成,并有效促进多杀菌素的生物合成,为研究其他正调控基因的过量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了重要基础。
- 蔡妹刘红雪杨琦孙运军胡胜标余子全黄伟涛丁学知夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌多杀菌素
- 苏云金芽孢杆菌NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的克隆和敲除载体的构建被引量：2
- 2012年
- 以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.
- 李今煜肖水华黄天培
- 关键词：苏云金芽孢杆菌基因敲除载体
- 球孢白僵菌不同感染方式侵染棉铃虫幼虫的毒性比较及组织病理变化被引量：12
- 2011年
- 为明确球孢白僵菌在不同感染方式下对棉铃虫的侵染能力,采用饲喂法和浸渍法测定了球孢白僵菌HFW-05对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)2龄幼虫的致病力,并通过组织切片显微技术、扫描电镜技术观察了球孢白僵菌HFW-05对棉铃虫的致病方式。结果表明:白僵菌HFW-05可通过消化道(饲喂法)成功侵染2龄棉铃虫,接种感染6d后的校正死亡率为75.8%。经由体表(浸渍法)接种白僵菌HFW-05的试虫,试验中体重的变化和取食量与对照相近(6d校正死亡率仅为17.3%,不能通过体表达到致病效果)。组织病理学变化表明:26±1℃条件下,HFW-05菌株对棉铃虫以消化道侵染为主,侵染后可导致寄主中肠微绒毛脱落严重,肠壁组织溶解并最终只剩余底膜;马氏管变形萎缩,边缘向外突出隆起,管径变大;脂肪体萎缩解体,结构松散;表皮下的细胞被菌丝侵染破坏。浸渍法接种的试虫,切片观察处理6d后试虫,体内未发现菌丝,肠壁组织正常完整。扫描电镜观察,浸渍法接种的分生孢子未能穿透棉铃虫表皮,而是贴于寄主表皮表面生长,在湿度合适的条件下,菌丝生长到一定时间后断裂成为芽生孢子。白僵菌HFW-05可经由消化道对棉铃虫达到较高的致病效果,在一定程度上弥补外界环境对白僵菌侵染的不利影响,对今后应用白僵菌进行生物防治具有重要意义。
- 曹伟平王刚甄伟王容燕杜立新宋健王金耀冯书亮
- 关键词：球孢白僵菌棉铃虫侵染过程组织病理
- 叶柄粘球菌STXZ77的分离鉴定及抗肿瘤活性被引量：3
- 2016年
- 目的:从土样中分离纯化粘细菌,对其进行鉴定与归类,以丰富粘细菌菌种资源,并对其进行抗肿瘤活性初步研究,为抗肿瘤药物开发奠定基础。方法:采用灭活大肠杆菌诱导法,从土样中分离纯化粘细菌,结合形态观察、生理生化特征及16S rRNA基因序列同源性分析进行菌株鉴定;向发酵液上清中加入XAD-16大孔吸附树脂提取发酵产物粗提物,CCK-8法进行体外抗肿瘤活性研究;RP-HPLC分离抗肿瘤活性组分,LC-MS/MS分析其分子质量。结果:分离并鉴定了STXZ77菌株,命名为Myxococcus stipitatus STXZ77。该菌株的发酵产物XAD-16树脂粗提物对小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠乳腺癌细胞4T1、人肝癌细胞SMMC-7721、人宫颈癌细胞He La、人结肠癌细胞SW480等多种肿瘤细胞具有较好的细胞毒性,作用24h的IC_(50)值分别为5.34μg/ml、13.50μg/ml、11.93μg/ml、28.70μg/ml、48.09μg/ml,而对正常细胞人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的毒性较小,IC_(50)值为17.09μg/ml,小于B16、4T1及SMMC-7721的细胞毒性。RP-HPLC分离得到抗肿瘤活性组分AP-C,质谱分析其分子质量为422.99m/z。结论:从土样中分离得到粘细菌Myxococcus stipitatus STXZ77,从该菌中分离得到抗肿瘤活性组分AP-C,具有开发成抗肿瘤药物的潜在价值。
- 雷良欢黄同龙魏慧廖继燕吴雨婧周偲夏立秋张友明
- 关键词：粘细菌纯化抗肿瘤
- 环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响被引量：5
- 2014年
- 【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S.spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S.spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S.spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S.spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S.spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S.spinosa-1。扫描电�
- 徐妙邬洋杨燕夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌多杀菌素RED
- 松材线虫分离及不同真菌对松材线虫繁殖的影响被引量：2
- 2011年
- 主要对松材线虫的取样分离进行探索,并初步研究了以真菌作为食料培养松材线虫。结果表明:取样部位对分离效果有影响,蛀孔及蛹室周围分离到的线虫量明显比枝条及树干其他部位多;不同真菌培养松材线虫效果有差异,主要采用了灰葡萄孢、黄瓜镰刀菌和香蕉镰刀菌3种真菌,通过设计不同影响因素比较培养效果,发现灰葡萄孢培养效果较为稳定且最佳,其次是黄瓜镰刀菌。因此,灰葡萄孢和黄瓜镰刀菌可选用于培养松材线虫。
- 黄响珠林秋秋吴远杰张灵玲关雄
- 关键词：松材线虫真菌
- 一株粘细菌Myxococcus sp.STXZ90的分离鉴定及生物活性分析被引量：1
- 2017年
- 采用灭活大肠杆菌诱导法分离粘细菌,通过形态观察、生理生化实验、16S rRNA基因序列同源性分析,对其进行鉴定并归类.并通过平板对峙法、肿瘤细胞毒性实验等检测粘细菌代谢产物的抑菌和抗肿瘤活性,RPHPLC分离抗肿瘤活性物质.分离得到一株粘细菌,鉴定结果表明该菌株为黄色粘球菌,将其命名为Myxococcus sp.STXZ90(简写为STXZ90).抑菌试验表明,STXZ90对多种人类病原菌及鱼类致病细菌如产气肠杆菌、嗜水气单胞菌等具有较高的抑制活性;STXZ90发酵上清的甲醇粗提物对多种肿瘤细胞具有广谱高效的抑制肿瘤细胞活性,对Hep-3B,Hela和HUVEC等的最低半抑制浓度(IC_(50))为0.279~1.228 mg/L.对该甲醇粗提物进行RP-HPLC分离,得到2个较纯的单峰物质,体外肿瘤细胞实验结果显示该组分有较强的抑制肿瘤细胞活性.
- 黄同龙雷良欢廖继燕周偲吴雨婧李纯魏慧夏立秋丁学知张友明
- 关键词：粘细菌次级代谢产物高效液相色谱
- 苏云金芽胞杆菌工程菌BIOT185对金龟子幼虫的田间防效及其安全性评价被引量：2
- 2011年
- 为评价苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）工程菌BIOT185对金龟子幼虫的田间防治效果以及其中间试验水平的安全性,在河北省定州市花生田开展了两年的田间小区试验。调查结果表明,每mL含100亿芽胞的工程菌BIOT185悬浮剂稀释10倍和100倍处理对金龟子幼虫具有较好的防治效果,虫口减退率可达52.08%-70.51%,保果效果为50.40%-66.57%,说明高浓度的BIOT185可以有效控制金龟子幼虫的危害。利用平板菌落计数法结合PCR检测发现,在施药后的365d中BIOT185在土壤中的菌量总体呈下降趋势;调查田间各小区的昆虫种群发现,工程菌BIOT185处理区与野生菌HBF-1、BT185以及对照区的昆虫种群差异不显著。说明BIOT185不会在土壤环境中大量残留,也不会影响花生田的昆虫种群。
- 杜立新王金耀王容燕曹伟平宋健冯书亮
- 关键词：苏云金芽胞杆菌工程菌防效金龟子幼虫
- Bt营养期杀虫蛋白Vip3及其作用受体的研究进展被引量：2
- 2013年
- 营养期杀虫蛋白Vip3是苏云金芽胞杆菌在对数生长中期开始分泌表达的一类对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的蛋白质,它与已知的杀虫晶体蛋白相似性很低。本文主要从vip3基因的挖掘,Vip3蛋白的特性、作用受体及其应用等方面作简要综述。
- 徐沙夏立秋丁学知
- 关键词：苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白
