国家高技术研究发展计划(2011AA10A213)
- 作品数：51 被引量：152H指数：7
- 相关作者：温永俊王凤雪武华蔡雪辉王刚更多>>
- 相关机构：中国农业科学院特产研究所东北农业大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金江苏省农业科技自主创新基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 表达PRRSV强弱毒Nsp2的Marc-145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响被引量：2
- 2012年
- 为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。
- 王凤雪刘准温永俊冷雪李真光武华
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞系
- 免疫增强剂对不同肉鸡禽流感疫苗免疫效果探讨被引量：2
- 2013年
- 试验将筛选获得的免疫增强剂与现有商品化禽流感疫苗混合后免疫10-15日龄的白羽肉鸡、黄羽肉鸡或麻鸡，在免疫后的第2、3、4周采血用于检测血凝抑制抗体效价，统计饲料用量，并在各品种鸡达到出栏日龄时，检测出栏重、料肉比和死淘率。结果显示，3种肉鸡免疫含免疫增强剂伴侣的H5亚型禽流感疫苗，抗体产生比常规疫苗提前1周达到710昏，平均HI抗体效价显著高于常规疫苗；不同疫苗免疫鸡与对照鸡在出栏重和料肉比方面无显著差异，在饲养期间无死淘情况。综合上述结果提示，免疫增强剂能显著提高禽流感疫苗在肉鸡的免疫效力，同时对生产性能无明显影响。
- 唐应华陆吉虎吴培培侯凤香刘振兴田震查国飞陈辉侯继波
- 关键词：免疫增强剂H5亚型禽流感疫苗肉鸡
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM株Nsp2基因缺失片段的原核表达及免疫活性分析被引量：2
- 2014年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株在细胞克隆纯化后得到非结构蛋白2(Nsp2)缺失的致弱毒株TJM株,根据GenBank数据库中公布的PRRSV TJ株F3代全基因序列设计合成引物,采用RTPCR方法扩增了PRRSV TJM株缺失片段dNsp2,利用原核表达载体pGEX-6p-1构建重组质粒GSTdNsp2,将重组质粒转入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,获得了可溶性表达的融合蛋白(GST-dNsp2)。经亲和柱层析纯化后,得到纯化的GST-dNsp2蛋白,含量1.6mg/mL。用PreScissionTM蛋白酶对融合蛋白GST-dNsp2进行解离,获得浓度为0.41mg/mL的目的蛋白dNsp2。对GST-dNsp2及dNsp2进行Western blot鉴定,证明表达的蛋白具有良好的反应性。本研究获得的GST-dNsp2及dNsp2为ELISA方法鉴别检测PRRSV TJ株与TJM株提供了基础资料。
- 黄双王凤雪温永俊高维凡
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因原核表达
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163 TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立
- 2012年
- 为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法在检测101copies/μL～108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系。标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100%和107%;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM)72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录水平显著上调。本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法。
- 韩梓峰刘永刚石文达王刚何玉利王淑杰刘鹤董建国武嘉男蔡雪辉
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR
- RNA干扰抑制家畜病毒感染的研究进展
- 2013年
- RNAi(RNA-mediated interference)是一种由序列特异性的dsRNA(double stranded RNA)作为触发器来触发同源mRNA降解从而引起基因沉默的细胞机制。利用RNAi方法可以通过沉默特异基因来对目的基因进行功能性分析,另外通过干扰RNA抑制病原性基因的表达来进行病毒性疾病治疗的研究已取得了显著的成就。作者对RNAi的作用机制、RNAi在抑制病毒复制和抵抗病毒感染动物方面的研究进展及应用前景和存在问题进行了综述。
- 黄双王凤雪温永俊
- 关键词：RNA干扰病毒感染
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位鉴定被引量：2
- 2014年
- 为制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究采用PCV2去核定位信号Cap蛋白(dCap),通过杂交瘤技术制备1株杂交瘤细胞株(4E2),制备小鼠腹水效价达1∶64 000,亚类鉴定为IgG1/κ链。Western blot分析显示,该株MAb与毕赤酵母表达的dCap和原核表达的Cap蛋白均可以发生特异性免疫反应。采用肽扫描法对MAb的非核定位信号区进行抗原表位鉴定,结果表明该MAb可以识别的线性表位区域为131TKATALTYDPYVNYSS146。本实验结果为进一步研究Cap蛋白的结构和PCV2临床检测方法的建立奠定基础。
- 张璐王延群郝立沙高明明李爱东陶冶李莉涂亚斌蔡雪辉路义鑫
- 关键词：猪圆环病毒2型DCAP单克隆抗体表位
- 猪O型口蹄疫病毒重组结构蛋白的纯化及间接ELISA方法的建立被引量：2
- 2013年
- 将猪O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的VP0、VP1、VP3基因,通过SUMO融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为55、48和40ku的融合蛋白,Western blotting检测结果表明,表达的蛋白质具有良好的生物学活性。采用亲和层析法纯化表达产物,分别以纯化的SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3蛋白为抗原建立了FMDV的间接ELISA检测方法。200份田间血清样品的检测结果表明建立的SUMO-VP0-ELISA、SUMO-VP1-ELISA、SUMO-VP3-ELISA检测方法均具有良好的特异性和敏感性。
- 宋妮王凤雪孙娜师新川温永俊武华
- 关键词：SUMO纯化间接ELISA
- HP-PRRSV HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒对仔猪外周免疫器官及肺脏的损伤被引量：1
- 2014年
- 为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株在其致弱过程中对仔猪外周免疫器官及肺脏损伤的变化,试验分别采用HuN4F5及其致弱代次F15、F23、F30及HuN4弱毒疫苗F112感染30日龄PRRSV抗原抗体阴性健康断奶仔猪,每天进行体温测定及临床症状观察,并在感染后0,3,5,7,10天检测病毒血症情况。病毒感染后10天剖杀试验猪,观察外周免疫器官及肺脏的病理变化并对肺脏和主要外周免疫器官病毒载量进行测定。结果表明:HuN4 F5、HuN4 F15组在临床症状、病毒血症、外周病毒载量及病理变化方面都明显比其他组严重,HuN4 F23组发病明显减轻,HuN4 F30组、HuN4 F112组无明显发病特征,与空白对照组无明显差异。说明HP-PRRSV HuN4株在致弱过程中,传代至30代时毒力发生显著减弱。
- 李爱东王刚刘永刚陶冶李莉涂亚斌王淑杰姜成刚蔡雪辉
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒致弱毒株肺脏病理损伤
- 猪全血中IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan定量RT-PCR方法的建立及对猪瘟疫苗的免疫评价被引量：1
- 2013年
- 为建立猪相关细胞因子的检测方法,本研究针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针,建立了这3种细胞因子TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法在101～109拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数R2均高达0.999。利用该方法对猪瘟(CSF)活疫苗进行细胞免疫评价,结果显示,CSF疫苗免疫组猪瘟病毒(CSFV)刺激细胞相对于空白对照细胞,IFN-γ、IL-2、TNF-αmRNA表达量在免疫后3 d～10 d之间均显著升高(p<0.05),而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达;对照组CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子表达量均无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性,对不同疫苗的细胞免疫反应评价是可靠的。
- 汪志艳刘永刚王刚石文达武嘉男涂亚斌姜成刚何玉利韩梓峰李玉明王延群蔡雪辉
- 关键词：全血猪瘟活疫苗
- 牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定被引量：4
- 2013年
- 为高效分泌表达牛α干扰素(boIFN-α),本研究通过人工合成boIFN-α基因,将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-boIFN-α,将其电转化于毕赤酵母菌株GS115,利用抗药选择压力G418筛选重组菌,对重组菌诱导表达,取上清进行SDS-PAGE和western blot检测,并优化重组菌的诱导表达条件。结果显示:筛选获得高效分泌表达boIFN-α的重组菌,其最佳诱导条件为:250 r/min,26℃培养,1%甲醇浓度诱导,诱导72 h。上清中目的蛋白表达量最高可达200μg/mL,本研究为boIFN-α在生产中的应用奠定了基础。
- 王延群张璐李玉明汪志艳金家民刘永刚王刚王淑杰姜成刚涂亚斌蔡雪辉
- 关键词：毕赤酵母分泌表达
