国家自然科学基金(31270715)
- 作品数：5 被引量：6H指数：2
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- 绿竹SEP3-like蛋白表达纯化以及不同结构域互作研究被引量：3
- 2016年
- 在双子叶植物中,SEPALLATA3(SEP3)参与生殖生长的很多方面,包括花分生组织和花器官的形成。但是在单子叶植物中,花器官形成的分子机制还不清楚。为了揭示单子叶植物中SEP3蛋白的结构以及聚合体的形成与生物学功能的关系,以单子叶植物绿竹Bambusa oldhami为材料,构建绿竹SEP3(BoSEP3)蛋白不同结构域原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组蛋白诱导表达,获得不同结构域的可溶蛋白,通过镍柱及分子筛分离纯化表明,BoSEP3蛋白K结构域以四聚体形式存在;同时构建BoSEP3蛋白不同结构域的酵母表达载体,通过酵母双杂交系统检验BoSEP3蛋白同源互作表明,K结构域有参与形成多聚体的功能。实验提供了一套表达纯化BoSEP3蛋白以及检验蛋白质互作的有效方案,为开展BoSEP3蛋白功能和结构生物学研究奠定了基础。
- 吴文魁周佳平林新春徐英武曹友志
- 关键词：蛋白质纯化酵母双杂交
- 利用酵母双杂交系统筛选雷竹SOC1相互作用蛋白
- 2016年
- 在雷竹（Phyllostachys violascens）中找到SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）在开花途径中的作用靶标,进一步探索SOC1的作用机制。构建pGBKT7-Pv SOC1诱饵表达载体,通过SMART技术构建开花时期的雷竹cDNA文库,酵母双杂交筛选与SOC1互作的蛋白,并对其进行分析鉴定。结果显示,成功构建了可用于酵母双杂交的cDNA文库,文库的转化率为每微克pGADT7-Rec 3.0×10~6转化子,文库滴度为7.5×10~6 cfu/m L,插入片段主要在250-2 000 bp之间。通过酵母双杂交实验得到与诱饵蛋白PvSOC1相互作用的蛋白,筛选到的靶标蛋白经鉴定是一个富含亮氨酸的蛋白激酶,特征氨基酸序列在不同物种中非常保守,与水稻中的同源蛋白亲缘性最高。
- 潘现飞施泉林新春徐英武曹友志
- 关键词：雷竹CDNA文库酵母双杂交
- 毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长被引量：1
- 2014年
- 3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp,可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性,而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明,该基因在根、茎和叶片中均有表达,但在根中相对表达量较高,此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外,发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在,并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。
- 张凤雪徐英武张智俊肖冬长王超莉屈亚平
- 关键词：林木育种学毛竹组织特异性表达原核表达
- 毛竹丙酮酸磷酸双激酶调节蛋白基因克隆、原核表达及纯化
- 2015年
- 丙酮酸磷酸双激酶调节蛋白(pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins,RP)是通过调控丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate,orthophosphate dikinase,PPDK)参与C4途径光合碳循环途径。毛竹Phyllostachys edulis作为一种重要的经济竹种,分析克隆RP基因对于竹类植物光合作用的研究具有重大理论和应用价值。通过逆转录实时聚合酶链式反应(RT-PCR)成功克隆得到毛竹Pe RP1,该基因c DNA全长1 275 bp,编码425个氨基酸;经生物信息学预测,该蛋白属于kinase-PPPase超家族,主要含有UDF 299保守结构域;经多序列比对发现毛竹Pe RP1蛋白与C3植物中RP1亲缘关系较近,而与C4植物亲缘关系较远。为了研究Pe RP1的蛋白质结构,我们将Pe RP1蛋白进行原核表达,利用Ni-NTA树脂亲和层析结合分子筛(SEC)层析的方法纯化得到了Pe RP1重组蛋白。SEC纯化的结果表明:Pe RP1蛋白在溶液中主要以多聚体形式存在,二聚体及单体含量较少,推测Pe RP1蛋白可能以多聚体形式参与调控PPDK蛋白。这为今后研究该蛋白的结构与功能打下了良好基础。
- 王超莉张智俊屈亚平王蕾
- 关键词：毛竹基因克隆原核表达蛋白纯化
- 拟南芥SPX1蛋白原核表达及纯化分析被引量：2
- 2015年
- 包含SPX结构域的蛋白在高等真核生物中广泛存在,这类蛋白的功能多数还不太清晰,但发现有些与磷信号相关,有些与铁信号相关。拟南芥中含有SPX结构域的蛋白可分为4个家族,本研究中的拟南芥SPX1(At SPX1)属于一个只含有SPX结构域的蛋白组成的家族,其它家族成员还包含额外的基因序列。进化树分析表明,At SPX1编码的氨基酸序列与双子叶植物具有较高的一致性,与单子叶植物进化距离较远。为了揭示At SPX1蛋白的结构形态与其生物学功能之间的联系,开展了At SPX1蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核体外表达载体,在大肠杆菌(E.coli)细胞中获得了该蛋白可溶性高表达。表达的蛋白包含有His标签方便了蛋白纯化,插入的SUMO融合蛋白标签可以通过蛋白酶切除,而目标蛋白通过硫酸铵沉淀实现了纯化。进一步分子筛层析分析表明At SPX1以单体形式存在。实验结果提供了一套表达纯化At SPX1蛋白的有效方案。
- 胡涛安艳吕群丹徐英武
- 关键词：原核表达蛋白纯化拟南芥
