国家自然科学基金(30900752)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位被引量：1
- 2011年
- 目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。
- 张红艳王春玉李彦姝王迪李丰
- 关键词：免疫沉淀
- Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达
- 2012年
- 目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测。结果:Smad2/3/4全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。
- 张红艳王春玉姚远李彦姝王迪李丰
- 关键词：SMAD融合蛋白
