国家自然科学基金(81200126)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
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- miR-20b慢病毒表达载体的构建及表达
- 2014年
- 目的构建鼠miR-20b慢病毒表达载体,检测其在P19细胞中的过表达效果。方法设计并合成含有miR-20b成熟序列的编码短发卡状RNA(shRNA)的双链DNA。将shRNA克隆入慢病毒载体,与Pcgvp、Rev和Vsvg包装质粒共转染HEK-293T细胞包装病毒,收取病毒上清液,纯化后感染P19细胞。荧光倒置显微镜下观察感染效率,实时定量PCR检测慢病毒感染后miR-20b的相对表达量。结果经双酶切分析及测序验证,成功构建了miR-20b的过表达载体。慢病毒感染P19细胞的效率可达到70%以上,miR-20b表达水平明显升高。结论成功构建了鼠miR-20b的慢病毒表达载体,包被的病毒可以在P19细胞中实现过表达效果。
- 朱莎莎朱春余章斌韩树萍朱金改彭宇竹
- 关键词：慢病毒P19细胞
- miR-20b过表达对P19细胞增殖和细胞分化的影响被引量：2
- 2014年
- 目的探讨miR-20b过表达对P19细胞增殖和细胞分化的影响。方法将包含鼠miR-20b成熟序列的慢病毒载体及空载体分别感染P19细胞,通过嘌呤霉素筛选2周,建立稳定过表达鼠mR-20b的P19细胞系。用Real-time PCR的方法验证稳定细胞表达株。用CCK-8方法检测稳定感染miR-20b过表达慢病毒和空载体的P19细胞间细胞增殖的差别。将稳定感染的两组细胞以无血清培养液37℃孵育24小时使细胞停留于G0期,而后恢复血清培养,取不同时间点的细胞,使用流式细胞仪检测两组间细胞周期的差别,从而间接验证CCK-8的结果。以1%二甲基亚砜(DMSO)将两组稳定感染的P19细胞诱导分化为心肌细胞,Real-time PCR检测心肌分化相关标志基因的表达,并用光镜观察分化过程中的形态变化。结果建立了稳定表达miR-20b的P19细胞系,与空载体组相比,miR-20b过表达可抑制P19细胞的增殖,促进心肌分化相关标志基因的表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。结论 miR-20b过表达可显著抑制P19细胞的增殖,并具有促进P19细胞向心肌细胞分化的作用。
- 朱莎莎刘雪华余章斌朱春李萌萌韩树萍胡晓山朱金改彭宇竹
- 关键词：P19细胞细胞增殖心肌分化
