国家科技重大专项(2008ZX08007-003)
- 作品数：9 被引量：21H指数：3
- 相关作者：石德顺刘庆友陆凤花王丹孟凡丽更多>>
- 相关机构：广西大学广西壮族自治区人口和计划生育研究中心吉林大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 黄牛卵母细胞和早期胚胎组蛋白乙酰化转移酶1表达模式研究
- 2009年
- 为探讨卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰基转移酶(HAT1)的表达规律,研究应用实时定量PCR技术,检测了广西本地黄牛卵母细胞和附植前胚胎HAT1基因的表达情况。结果表明:HAT1基因在黄牛生发泡期(GV)卵母细胞、第2次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞、体外受精(IVF)胚胎2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为1.00、0.56、0.08、0.55、0.43和0.31,在孤雌激活(PA)胚胎的2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为0.55、0.55、0.48和0.46。HAT1在GV期相对表达量最高,在IVF胚胎中2～4细胞表达量最少(P<0.05)。由此可见,HAT1基因在黄牛卵母细胞成熟和早期胚胎阶段均有表达,GV期HAT1基因的表达最高,PA胚胎HAT1基因的表达较稳定。
- 刘庆友公方强蒋建荣崔奎青石德顺
- 关键词：卵母细胞早期胚胎黄牛
- 大鼠OSP-1启动子克隆与表达检测被引量：2
- 2010年
- [目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子(OSP-1)片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PCR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP-1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP-N1载体,构建真核表达载体pOSP-1-EGFP-N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。[结果]OSP-1启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96%;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA-TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C/EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特异性表达转基因载体奠定了基础。
- 于今非李明鸿谢琴刘庆友石德顺
- 关键词：水牛
- 水牛和黄牛同种及种间显微授精(ICSI)的初步研究
- 2011年
- 试验探讨了水牛和黄牛同种及种间显微授精的可行性。体外成熟22～24h的水牛和黄牛卵母细胞分别注入冷冻/解冻的尼里-拉菲水牛和利木赞黄牛精子,进行同种或种间的显微授精操作,构建的ICSI胚胎一部分培养到16～18h固定染色检查原核形成情况,另外一部分胚胎培养2～9d分别记录胚胎的分裂情况及囊胚发育情况。结果发现,水牛同种(水牛+水牛)和水牛异种(水牛+黄牛)显微授精胚胎的双原核率(47.73%和36.67%)、分裂率(68.00%和72.64%)和囊胚发育率(16.44%和22.39%)均无显著差异(P>0.05);黄牛同种(黄牛+黄牛)和黄牛异种(黄牛+水牛)显微授精胚胎的双原核率(60.00%和45.28%)、分裂率(73.33%和71.31%)和囊胚发育率(28.57%和33.70%)亦无显著差异(P>0.05)。以上结果表明:①水牛精子注射到黄牛卵子和黄牛精子注射到水牛卵子的种间授精胚胎均可以体外发育到囊胚阶段;②黄牛卵子无论同种和种间显微授精的效果均优于水牛卵子。
- 牛向丽陆凤花石德顺张艳玲卢晟盛
- 关键词：水牛黄牛显微受精异种
- 水牛OGT基因的克隆与序列分析
- 本研究目的是通过对OGT基因cDNA的克隆和分析，明确水牛OGT的序列及其结构特点，并进行生物信息学分析，为进一步研究水牛OGT基因结构、基因表达与调控奠定基础。本研究对水牛OGT基因CDS克隆和测序结果进行同源性多重序...
- 李楠陆凤花孙洪亮朱鹏柯浩张顺蒋建荣石德顺
- 关键词：水牛基因克隆
- 神经生长因子NGF及其受体TrkA在雌性水牛生殖器官的表达定位被引量：10
- 2011年
- 为研究神经生长因子NGF及其受体TrkA在广西雌性水牛生殖器官中表达定位情况,运用免疫组织化学ABC法对处于发情周期不同阶段(卵泡期、黄体期)成年水牛的卵巢、子宫、输卵管NGF、TrkA分别进行染色定位。结果表明:NGF/TrkA阳性细胞在卵巢主要见于卵泡内膜细胞、颗粒细胞及黄体细胞;在子宫主要见于子宫内膜上皮细胞、腺体细胞;在输卵管主要见于输卵管的柱状上皮纤毛细胞。不同阶段NGF、TrkA的表达量也有所差异,卵巢中NGF、TrkA的表达量在卵泡期与黄体期相比没有显著差异;子宫中卵泡期NGF的表达量高于黄体期,TrkA的表达量在卵泡期与黄体期相比没有明显差异;输卵管中卵泡期NGF、TrkA的表达量均高于相应黄体期。
- 朱晓玲李成娇侯晓峰石德顺刘庆友周虚
- 关键词：神经生长因子TRKA水牛生殖器官
- 一例转基因克隆水牛主要脏器组织结构观察
- 2013年
- 应用石蜡切片及HE染色技术观察转基因克隆水牛牛犊的心脏、肝、肾、胰腺、睾丸等主要脏器组织结构,并使用激光共聚焦显微镜对其心脏、肝、肾、睾丸冰冻组织切片进行荧光观察。结果表明,转基因克隆水牛心脏结构异常,心肌纤维间隙过大,闰盘结构不明显,出现炎症、出血等病理现象;肝、肾、胰腺、睾丸结构完整,细胞形态、分布均正常。激光共聚焦显微镜下各冰冻组织切片中均可见较均匀绿色荧光,初步证实绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因成功整合到了水牛体内。
- 卢俊求胡巍堃周悦王晓丽
- 关键词：水牛转基因克隆脏器
- 奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达
- 2011年
- 为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)基因序列(NM_000239.2)设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(12.2kb)。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。
- 刘庆友刘晟王丹李辉李湘萍罗婵陆凤花石德顺
- 关键词：奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因转基因载体
- 不同精子处理对应用ICSI-Tr技术生产转基因水牛胚胎效率的影响被引量：4
- 2011年
- 本文主要探讨了不同精子处理对应用显微授精介导(intracytoplasmic sperm injection-mediated trans-genesis,ICSI-Tr)生产转基因水牛胚胎效率的影响。本试验以p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP为载体,比较了精子的不同处理方式(NaOH和冻融)、NaOH处理精子不同时间(5min,10min,20min,30min和60min)以及不同外源DNA浓度(5ng/μL,10ng/μL,25ng/μL和50ng/μL)对ICSI-Tr转基因效率的影响。结果显示:NaOH处理组的囊胚EGFP表达率(46.1%),与冻融精子处理组(47.1%)差异不显著,但发育率显著高于冻融处理精子组(28.3%vs16.7%,P<0.05)。处理60min组和30min组的分裂率分别为78.9%和77.5%,显著高于20min、10min和5min组的64.0%、60.0%和64.0%(P<0.05),其中30min处理组的囊胚EGFP表达率高达44.4%,显著高于其它处理组(P<0.05)。25ng/μL组和50ng/μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著(41.3%vs42.5%),但显著高于5ng/μL组和10ng/μL组(22.5%和35.5%),25ng/μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其它组(P<0.05)。本研究优化了应用ICSI-Tr生产转基因水牛胚胎技术体系,为获得ICSI-Tr转基因水牛奠定了良好的工作基础。
- 刘庆友王丹张会娜陈自洪孟凡丽陆凤花石德顺
- 关键词：水牛
- 水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究被引量：3
- 2012年
- [目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22 h后随机分为2组:①在体外受精7～10 h或18～20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P>0.05),且IVF 7～10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18～20 h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10 h注射的效果优于IVF后18～20 h注射。
- 陈自洪崔奎青孟凡丽刘玉兵王丹陆凤花石德顺
- 关键词：水牛受精卵转基因
- 水牛小腔卵泡分离方法的初步研究被引量：3
- 2011年
- 本研究比较了不同的分离方法和酶作用的不同时间,以及不同的卵巢表面状态等因素对水牛小腔卵泡分离效果的影响,以期建立有效的水牛小腔卵泡分离体系。结果发现,采用机械与酶结合的方法分离水牛小腔卵泡时,平均每个卵巢获得5.64个小腔卵泡,显著高于机械法分离平均每个卵巢获得的3.12个小腔卵泡数(P<0.05);当胶原蛋白酶作用12或15min,每个卵巢平均获得的小腔卵泡数均显著高于5和10min处理组(P<0.05),两组之间没有显著差异(P>0.05),但当消化时间延长到20min时,卵泡膜被酶消化而破裂,没法分离到小腔卵泡;从表面小于2mm卵泡且无黄体的卵巢分离获得的小腔卵泡平均数显著高于表面无可见卵泡且有黄体的卵巢组的平均数(7.50和2.25,P<0.05)。以上结果表明,选用表面无小于2mm卵泡且无黄体的卵巢,采用机械与酶结合的方法,酶作用时间为12～15min分离水牛的小腔卵泡,可获得的小腔卵泡数量最多。
- 李翠玲李楠黄章虎蒋建荣陆凤花石德顺
- 关键词：水牛小腔卵泡
